淫羊藿甙誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化實驗研究

黃荷，曾意榮，簡林養(yǎng)

1.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510800；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

◆實驗研究論著◆

淫羊藿甙誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化實驗研究

黃荷1，曾意榮2，簡林養(yǎng)1

1.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510800；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

目的：觀察淫羊藿甙對人骨髓間充質(zhì)干細胞（hMSCs）向軟骨細胞誘導分化的作用。方法：骨髓樣本取自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院關節(jié)一科因骨關節(jié)炎行全髖關節(jié)置換手術的病人，用含有1mL肝素（100 U/mL）的注射器抽取骨髓5 mL，并立即送入實驗室進行體外培養(yǎng)。收集體外增殖培養(yǎng)第3代的細胞，分5組：未誘導組、對照組、淫羊藿甙低劑量組、淫羊藿甙中劑量組、淫羊藿甙高劑量組。置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液1次，培養(yǎng)21天。甲苯胺藍染色及SABC免疫組化法檢測軟骨細胞，并定量測定膠原α1mRNA表達水平。結(jié)果：甲苯胺藍染色鑒定：淫羊藿甙高劑量組和對照組染色均可見胞漿成紫紅色質(zhì)，表明糖氨聚糖含量豐富，hMSCs向軟骨細胞分化；淫羊藿甙低、中劑量組及未誘導組染色未見特征性紫紅色異染，表明hMSCs未見明顯軟骨分化。Ⅱ型膠原SABC免疫組化法鑒定：淫羊藿甙高劑量組和對照組免疫組化染色后可見棕黃色膠原顆粒，淫羊藿甙高劑量組最為密集，表明Ⅱ型膠原含量多，hMSCs向軟骨細胞分化顯著；淫羊藿甙低、中劑量組見少量棕黃色膠原；未誘導組未見膠原染色。從熒光定量PCR檢測結(jié)果分析，淫羊藿甙高劑量組、對照組Ⅱ型膠原相對表達量較高，2組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。淫羊藿甙低、中劑量組Ⅱ型膠原相對表達量較低，2組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。未誘導組無膠原表達。結(jié)論：淫羊藿甙可在體外誘導hMSCs分化為軟骨細胞。

淫羊藿甙；骨髓間充質(zhì)干細胞；軟骨細胞；分化；誘導

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是一群具有多向分化潛能的均質(zhì)性細胞，作為種子細胞能夠根據(jù)微環(huán)境信號的指令分別分化為成骨細胞和軟骨細胞，適合于伴隨軟骨下骨損傷的軟骨缺損修復。從骨代謝進行研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs的生物學特性與中醫(yī)理論“腎主骨生髓”存在相關性。骨、軟骨的生長、修復均依賴于腎中精氣所提供的濡養(yǎng)和推動。以往多以動物來源的BMSCs作為研究對象，本實驗擬研究補腎中藥淫羊藿的有效活性單體成分淫羊藿甙對人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)向軟骨細胞的誘導分化的作用，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 骨髓樣本取自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院關節(jié)一科因骨關節(jié)炎行全髖關節(jié)置換手術的患者，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會IRB允許并征得患者知情同意，從病人股骨近端髓腔中抽取獲得。用含有1 mL肝素(100 U/mL)的注射器抽取骨髓5 mL，并立即送入實驗室進行體外培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；胰酶(北京索萊寶生物公司)；轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β，美國Peprotech公司)；維生素C(上海江萊生物科技有限公司)；地塞米松(上海晶天生物科技有限公司)；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒酸鈉(美國Sigma公司)；小鼠抗人膠原蛋白Ⅱ單抗(Santa公司)；PE標記二抗小鼠 IgG(美國BioLegend)；RNA提取試劑盒(北京TIANGEN公司)；DNA聚合酶(北京TIANGEN公司)；NTP mix(北京TIANGEN公司)；引物合成(大連TaKaRa公司)；探針合成(大連TaKaRa公司)；磷酸緩沖鹽溶液1×PBS(pH=7.4)(北京索萊寶生物)；雙抗(美國Gibco公司)。

1.3 主要儀器 75 cm2培養(yǎng)瓶，25 cm2培養(yǎng)瓶；50 mL離心管，15 mL離心管(美國Corning公司)；24孔培養(yǎng)板(丹麥Nunc公司)；25 mL移液管，10 mL移液管，5 mL移液管，2 mL移液管(美國Corning公司)；6孔板(Coning)；酶標儀，CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)；針頭濾器，0.22 μm濾膜(MILLIpore)；SIGMA-3K15離心機(sigma)。免疫熒光纖維鏡(日本奧林巴斯公司)；Real-time PCR(美國ABI公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.4 細胞分組及處理 收集體外增殖培養(yǎng)第3代的細胞，分5組：未誘導組，hMSCs不加誘導劑繼續(xù)培養(yǎng)；對照組，加入誘導液(TGF-β10 μg/L、Dex0.1 μmol/L、VitC50 mg/L)；淫羊藿甙低劑量組，在含10%FBS H-DMEM培養(yǎng)基中加入淫羊藿甙(終濃度為20 μg/L)；淫羊藿甙中劑量組，在含10% FBS H-DMEM培養(yǎng)基中加入淫羊藿甙(終濃度為40 μg/L)；淫羊藿甙高劑量組，在含10%FBS H-DMEM培養(yǎng)基中加入淫羊藿甙(終濃度為60 μg/L)。置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液1次，培養(yǎng)21天。

1.5 軟骨細胞鑒定 ①甲苯胺藍染色：甲苯胺藍染色顯示軟骨細胞周圍異染性。糖氨聚糖用甲苯胺藍等堿性染料染色后呈紫紅色，而不是藍色，這種染色現(xiàn)象稱為異染性(metachromasia)基質(zhì)。②SABC免疫組化法：胞漿Ⅱ型膠原免疫著色為棕黃色。以4%多聚甲醛固定20 min，并滅活內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA室溫封閉20 min。滴加1∶100的兔抗膠原Ⅱ一抗，4℃過夜，陰性對照以PBS代替一抗。PBS洗滌2 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃恒溫箱20 min，PBS洗滌5 min×4次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色8 min，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染10 s，充分水洗。梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。③膠原α1 mRNA表達水平定量測定。用Trizol試劑裂解沉淀細胞后，提取總mRNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。在PE7700熒光定量PCR儀上定量檢測膠原α1mRNA表達水平。反應體系為：ddH2O 10.105mL，cDNA 1 mL，2×SYBR Green QPCR master mix 12.5 mL，ROX passive reference 0.375 mL，F(xiàn)orward primer(10 mmol/L)0.5 mL， Reverse primer (10mmol/L)0.5 mL，probe(10 mmol/L)0.2 mL，總體積25 mL。Ⅱ型膠原α1反應條件為：95℃預變性10 min，95℃2 min，60℃30 s，72℃1.5 min，共40個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)進行建立熔解曲線的反應，最后用專用軟件自動分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組軟骨細胞鑒定結(jié)果比較 見圖1、圖2。甲苯胺藍染色鑒定：淫羊甙藿高劑量組和對照組染色均可見胞漿成紫紅色質(zhì)，表明糖氨聚糖含量豐富，hMSCs軟骨細胞分化；淫羊藿甙低、中劑量組及未誘導組染色未見特征性紫紅色異染，表明hMSCs未見明顯軟骨分化。Ⅱ型膠原SABC免疫組化法鑒定：淫羊藿甙高劑量組和對照組免疫組化染色后可見棕黃色膠原顆粒，淫羊藿甙高劑量組最為密集，表明Ⅱ型膠原含量多，hMSCs軟骨細胞分化顯著；淫羊藿甙低、中劑量組見少量棕黃色膠原；未誘導組未見膠原染色。

圖1 高劑量淫羊藿甙組甲苯胺藍染色結(jié)果（×40）

圖2 高劑量淫羊藿甙組Ⅱ型膠原SABC免疫組化法鑒定（×40）

2.2 各組膠原mRNA定量結(jié)果比較 見表1。從熒光定量PCR檢測結(jié)果分析，淫羊藿甙高劑量組、對照組Ⅱ型膠原相對表達量較高，2組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。淫羊藿甙低、中劑量組Ⅱ型膠原相對表達量較低，2組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。未誘導組無膠原表達。

表1 各組膠原蛋白mRNA定量結(jié)果比較()

表1 各組膠原蛋白mRNA定量結(jié)果比較()

淫羊藿甙低劑量組淫羊藿甙中劑量組淫羊藿甙高劑量組原Ⅱ檢出1 . 2 2 7 . 5 7 ± 2 . 3 4 7 . 0 5 ± 3 . 3 8 2 . 6 3 ± 1 . 2 9 1 8 S 2 . 5 4 ± 2 . 0 6 6 . 0 1 ± 2 . 1 3 6 . 6 2 ± 2 . 6 4 5 . 5 8 ± 3 . 5 5 6 . 0 1 ± 2 . 3 4 Δ Δ C t -3 . 1 8 ± 1 . 1 1 0 . 9 5 ± 0 . 8 8 1 . 4 7 ± 0 . 2 3 -3 . 3 8 ± 1 . 2 4 2 -ΔΔCt9 . 0 6 ± 5 . 4 6 0 . 5 1 ± 0 . 3 3 0 . 3 6 ± 0 . 5 4 1 0 . 4 1 ± 4 . 7 8基因C t值

3 討論

骨關節(jié)炎的病理學特點是以嚴重的局限性軟骨破壞，深達骨質(zhì)為特點。如何修復受損的關節(jié)軟骨并保持其功能，是骨關節(jié)炎的治療目標。而臨床上軟骨缺損的治療一直是個難題，主要是因為軟骨自身修復能力弱，甚至不存在。而應用軟骨細胞移植修復也不能成功，原因主要是由于軟骨細胞幾乎沒有遷移能力，不能迅速聚集到創(chuàng)傷部位。而BMSCs具有強大的增殖能力、多向分化能力及低免疫原性，貼壁生長特性等等，而這些特性正可以使BMSCs成為種子細胞來修復軟骨缺損。因此，對軟骨缺損的修復轉(zhuǎn)向干細胞誘導分化成軟骨細胞研究。

軟骨細胞占關節(jié)軟骨總?cè)萘康?%左右，它的功能是合成分泌并維持外基質(zhì)。關節(jié)軟骨的正常生理功能依賴于軟骨細胞和細胞外基質(zhì)的代謝平衡。細胞外基質(zhì)主要由組織液、膠原、蛋白聚糖、非膠原蛋白等組成[1]。其中膠原纖維是軟骨的基本框架，膠原纖維占成人關節(jié)軟骨干重的2/3，而Ⅱ型膠原占膠原總數(shù)的80%～90%，由3條α1鏈以螺旋方式組成[2]。Ⅱ型膠原是關節(jié)軟骨的重要組成成分，對維持關節(jié)軟骨的彈性及硬度具有重要作用。在骨關節(jié)炎的發(fā)病過程中最主要的特點是關節(jié)軟骨的進行性丟失[3]，Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的破壞最為顯著，影響了關節(jié)軟骨的正常生理功能。有研究表明，以豬Ⅱ型膠原移植修復新西蘭大白兔的關節(jié)軟骨缺損，收到良好效果[4]。而最理想的軟骨修復是建立軟骨細胞與Ⅱ型膠原的合成分解代謝平衡體系，這樣才能獲得持久的效果。本研究通過中藥單體淫羊藿甙誘導BMSCs向軟骨細胞分化，甲苯胺藍染色陽性，Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性均提示誘導細胞表達特異性細胞基質(zhì)，這兩者是軟骨細胞的特征性標志，說明誘導細胞具有軟骨細胞的特點。本實驗結(jié)果提示，淫羊藿甙可在體外誘導hMSCs分化為軟骨細胞，為今后臨床應用hMSCs修復軟骨的治療提供了細胞分子生物學水平的初步依據(jù)。

中藥的體外藥理實驗因中藥本身的特點實施困難。目前常采用的方法是“含藥血清”實驗方法。所謂“含藥血清”，是指給動物或人服用一定量的藥物后，經(jīng)過一定的時間采血所獲得的血清，以模擬并試圖替代藥物本身而供實驗研究使用的一種非單體藥物藥理研究的方法。近年來，該方法開始引起眾多研究者的重視，并做了廣泛的研究，有效地帶動了中藥及復方體外藥效學及藥理學評價研究的發(fā)展，但也逐漸暴露出其自身無法克服的弊端：無法確定最佳給藥方案；無法做到體外培養(yǎng)體系內(nèi)藥物濃度與血藥濃度相等又不影響組織、細胞生長；藥效最佳的采血時間難以確定；血清成分復雜，不可控的影響因素太多，實驗結(jié)果重復性差；血清本身固有的活性成分常影響試驗結(jié)果，缺乏去除血清影響的理想措施[5]。而中藥單體成分簡單，避免了中藥制劑中的多種雜質(zhì)，電解質(zhì)以及不同的酸堿度對體外培養(yǎng)系的影響，提高了研究結(jié)果的可靠性，從而對中藥進行細胞學水平研究具有可行性。

淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其味辛甘，性溫，入肝腎二經(jīng)，具有補腎壯陽，祛風除溫等功效。用于陽萎遺精、筋骨痿軟、風濕痹痛、麻木拘攣等?，F(xiàn)代化學研究表明，淫羊藿單體成分淫羊藿甙為主要有效成分，具有廣泛藥理作用，可補腎陽，強筋骨[6]。藥理學試驗表明，其對于去卵巢腎陽虛造模的大鼠骨質(zhì)疏松具有明顯的藥理作用[7]。

BMSCs體外向軟骨細胞分化受諸多生物學因素的影響，包括細胞培養(yǎng)微環(huán)境，細胞因子的參與、藥物等等。目前誘導BMSCs向軟骨細胞分化常用的誘導劑多由TGF-β、胰島素，地塞米松等組成[8]。近來實驗發(fā)現(xiàn)，以中藥制劑作為誘導劑也取得成功[9～10]。本組實驗研究發(fā)現(xiàn)，含10%FBS H-DMEM培養(yǎng)基中加入淫羊藿甙能誘導BMSCs向軟骨細胞分化，熒光定量PCR可以檢測到Ⅱ型膠原表達。淫羊藿甙高劑量組誘導BMSCs軟骨細胞分化顯著。中醫(yī)學認為，“腎主骨”“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，骨生髓”，現(xiàn)代醫(yī)學已經(jīng)證實，補腎之法可以治療骨質(zhì)疏松、關節(jié)軟骨退行性變。高劑量的淫羊藿甙有較強的補腎陽，強筋骨的功效，這種治療作用與誘導BMSCs成軟骨細胞分化的機制可能有內(nèi)在的相關性。

［參與文獻］

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[5]張紅敏，謝春光，陳世偉.含藥血清體外藥理試驗的評價[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，24(8)：741-745.

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[9]吳追樂，劉獻祥，李西海，等.透骨消痛顆粒誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞的分化[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(33)：6456-6460.

[10]湯治黎，章漢平，李源，等.丹參注射液誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為軟骨細胞的研究[J].湖北中醫(yī)雜志，2008，30(6)：11-12.

（責任編輯：駱歡歡）

R285.5

A

0256-7415（2016）01-0210-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.01.095

2015-06-11

廣州市花都區(qū)科技計劃項目（12-HDWS041）

黃荷（1974-），男，副主任中醫(yī)師，研究方向：骨關節(jié)疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。