甲醛固定與微波固定在消化道內(nèi)分泌細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色中的比較

李明華　史鵬飛

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甲醛固定與微波固定在消化道內(nèi)分泌細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色中的比較

李明華1史鵬飛2

【摘要】目的 探討微波固定在消化道內(nèi)分泌細(xì)胞免疫組化染色中的方法。方法 應(yīng)用不同強(qiáng)度的微波輻射與常規(guī)福爾馬林方法固定組織，并用石蠟切片免疫組化染色觀察。結(jié)果 常規(guī)福爾馬林固定經(jīng)抗原修復(fù)后，經(jīng)染色內(nèi)分泌細(xì)胞呈棕黃色，不經(jīng)抗原修復(fù)內(nèi)分泌細(xì)胞能著色，用微波輻射低檔達(dá)45℃、55℃、70℃固定的組織都能被著色。結(jié)論 微波固定組織切片染色效果優(yōu)于常規(guī)福爾馬林固定組織，縮短固定時(shí)間，微波固定的材料能很好的保存抗原。

【關(guān)鍵詞】微波；石蠟切片；消化道；內(nèi)分泌細(xì)胞

作者單位：1 462000漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部；2 462000漯河市中心醫(yī)院創(chuàng)傷骨科

微波輻射能使液體中極性分子高頻振動(dòng)，增加液體分子間的摩擦和碰撞，加快液體內(nèi)部迅速產(chǎn)熱和某些化學(xué)反應(yīng)。許多學(xué)者利用此原理進(jìn)行了微波輻射固定組織的實(shí)驗(yàn)[1-4]，均取得良好的效果。但微波輻射固定某些特定組織在免疫組化染色中的具體方法報(bào)道較少，為了拓展微波在組織切片中的應(yīng)用，探討微波輻射固定胃腸內(nèi)分泌細(xì)胞在免疫組化中的具體方法，比較甲醛與微波固定的不同。微波固定比常規(guī)固定時(shí)間短，提高了免疫組織化學(xué)對(duì)基礎(chǔ)、預(yù)防、臨床和軍事醫(yī)學(xué)的研究都有重要的價(jià)值，具體報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料與主要儀器

對(duì)照組1～4為蟾蜍胃，對(duì)照組5～8為蟾蜍小腸，實(shí)驗(yàn)組1～6為蟾蜍胃，輻射儀器為海爾牌H-R 7 751 MS型家用微波爐（750 W，分6檔），0.01 mol/LPBS液（pH 7.4），0.01 mol/L，pH 6.0檸檬酸緩沖液（CB），羊血清和二抗Maixin試劑（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），一抗（胃泌素，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；5-HT，博士德生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（試劑A濃縮緩沖液，試劑B濃縮DAB溶液，試劑C濃縮過氧化氫溶液）。

1.2固定方法

將材料分成14個(gè)組，8個(gè)對(duì)照組用常規(guī)福爾馬林固定，6個(gè)實(shí)驗(yàn)組用微波輻射，先用生理鹽水進(jìn)行測(cè)試，找出符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的微波輻射檔次和恰當(dāng)?shù)妮椛鋾r(shí)間。微波輻射方法：將實(shí)驗(yàn)組1～6材料放于小白廣口瓶（容量60 ml）內(nèi)加20 ml生理鹽水，而后放在內(nèi)盛400 ml水的玻璃器皿上方并一同放入微波爐內(nèi)，實(shí)驗(yàn)1、2組，水+微波達(dá)45℃，實(shí)驗(yàn)3、4組，水＋微波達(dá)55℃，實(shí)驗(yàn)5、6組，水+微波達(dá)70℃。

2　結(jié)果

2.1對(duì)照組

組織結(jié)構(gòu)與透明：胃腸壁組織結(jié)構(gòu)完整，透明度良好，各類細(xì)胞均有一定程度的收縮。結(jié)締組織內(nèi)常有較大的空隙，腺管腔擴(kuò)大，腸黏膜上皮間有一定裂隙。組織著色：對(duì)照組的內(nèi)分泌細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色呈棕黃色，結(jié)締組織與其他的結(jié)構(gòu)不著色。對(duì)照組1、3、5、7比對(duì)照組2、4、6、8效果更明顯。

2.2實(shí)驗(yàn)組

實(shí)驗(yàn)組3、4組織結(jié)構(gòu)與透明：胃壁組織無損傷，基本透明，細(xì)胞無收縮，胞質(zhì)均勻，胞間隙與各腺管腔正常，胞間隙清晰，內(nèi)分泌細(xì)胞正常，透明清晰。組織著色：內(nèi)分泌細(xì)胞著色比對(duì)照組著色深，其他細(xì)胞不著色。從整體效果看，組織完整性好，細(xì)胞形態(tài)好，內(nèi)分泌細(xì)胞著色深，效果優(yōu)于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組5、6組織透明性好，胃壁黏膜表層有損傷，細(xì)胞膨脹，免疫組化染色內(nèi)分泌細(xì)胞著色。結(jié)締組織與其他組織不著色。實(shí)驗(yàn)組1、2胃壁黏膜多與其他層次脫離，內(nèi)分泌細(xì)胞也可染色，透明較差。

3　討論

通過以上實(shí)驗(yàn)組5、6提示胃黏膜淺層損傷，結(jié)締組織損傷和內(nèi)分泌細(xì)胞膨脹可能是微波輻射過量所致。實(shí)驗(yàn)組1、2提示胃黏膜與其他組織脫離，組織透明不良，可能是組織固定不夠所致。實(shí)驗(yàn)組3、4組織結(jié)構(gòu)完整性與染色均良好，提示單獨(dú)微波輻射能良好的固定內(nèi)分泌細(xì)胞，微波達(dá)55℃是理想的微波輻射量。組織完整性好，透明好，細(xì)胞無損傷，無收縮，胞質(zhì)均勻，經(jīng)免疫組化染色鮮明。常規(guī)福爾馬林固定使細(xì)胞有一定的收縮，能使內(nèi)分泌細(xì)胞著色，而微波輻射固定既能保持細(xì)胞正常的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，經(jīng)免疫組化染色又能使內(nèi)分泌細(xì)胞著色。說明微波輻射既能良好的固定內(nèi)分泌細(xì)胞，又能很好的保護(hù)組織細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

由于當(dāng)前對(duì)甲醛固定組織所發(fā)生的反應(yīng)，尤其對(duì)蛋白質(zhì)的立體構(gòu)象會(huì)發(fā)生的影響尚不十分清楚，導(dǎo)致對(duì)抗原修復(fù)的機(jī)制也不很清楚?？赡艿臋C(jī)制主要是：（1）由于甲醛固定可使蛋白與甲醛、蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間通過甲基化橋形成交聯(lián)，抗原決定簇被遮蔽，可通過高溫、鹽緩沖液使交聯(lián)的蛋白水解，斷開交聯(lián)[5]。（2）組織用甲醛固定時(shí)，會(huì)形成蛋白-甲醛-鈣復(fù)合體，并遮蔽了抗原決定簇，可通過高溫使鈣離子釋放，并與修復(fù)液中的螯合物-檸檬酸結(jié)合，暴露抗原決定簇[5]。（3）還有觀點(diǎn)認(rèn)為[5]，經(jīng)甲醛固定后，可形成甲醛化蛋白的三維空間，加熱后可恢復(fù)蛋白質(zhì)自然的三維空間，使抗原得以修復(fù)。甲醛固定使抗原決定簇遮蔽，微波固定，不存在抗原決定簇遮蔽。

綜上所述，材料經(jīng)微波輻射后經(jīng)免疫組化染色整體效果優(yōu)于對(duì)照組，這些方法不僅縮短了制片時(shí)間，而且在臨床疾病研究有了重大的突破。更重要的是還在理論上提示經(jīng)抗原修復(fù)與不經(jīng)修復(fù)都著色，微波處理也著色。

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Comparison the Formaldehyde Fixed and Microwave Fixed in Gastrointestinal Endocrine Cells of Immunohistochemistry

LI Minghua1SHI Pengfei21 Faculty of Basic Medicine, Luohe Medical Junior College, Luohe 462000, China. 2 Traumatic Orthopedics Department, Luohe City Central Hospital, Luohe 462000, China

[Abstract]Objective To explore the formaldehyde fixed and microwave fixed gastrointestinal endocrine cells in the immune group. Methods Different intensity of microwave radiation and conventional method of formalin fixed, and paraffin sections immunohistochemical staining observed. Results Formalin fixed by conventional antigen restored, the endocrine cells were stained brown, without antigen endocrine cells can not stained,with microwave radiation of low-grade 45℃, 55℃, 70℃ fixed tissue can be contracted. Conclusion The staining effects of the paraffin section prevail over the paraffin section from routine formalin fixated specimens. The method above make the time of fixating tissue shorten, microwave fixed material could save antigen better.

[Key words]Microwave, Paraffin sections, Digestive tract, Endocrine cell

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.02.083

【文章編號(hào)】1674-9308（2016）02-0116-02

【中圖分類號(hào)】R364.7

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A