鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對帕金森病肝陽上亢證大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響＊

李曉明，張麗華，綦艷秋，孫 影，朱蘭芹，董妙先＊＊

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究所 齊齊哈爾 161006；2. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生所 齊齊哈爾 161006）

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對帕金森病肝陽上亢證大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響＊

李曉明1，張麗華2，綦艷秋2，孫 影2，朱蘭芹2，董妙先2＊＊

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究所 齊齊哈爾 161006；2. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生所 齊齊哈爾 161006）

目的：觀察鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對帕金森?。≒arkinson’s Disease，PD）肝陽上亢證模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響，探討其可能的作用機制。方法：采用附子湯灌胃聯(lián)合6-OHDA偏側(cè)毀損制備PD肝陽上亢證大鼠模型，肝熄風(fēng)湯灌胃給藥28天。觀察阿樸嗎啡誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為，采用實時熒光定量PCR檢測編碼核因子E2相關(guān)因子2（Transcription Factor NF-E2-Related Factor 2，Nrf2）基因Nfe2l2和編碼血紅素加氧酶-1（Heme Oxygenase 1，HO-1）的基因Hmox-1的表達(dá)，采用Western blot檢測Keap1蛋白表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯顯著減少了阿樸嗎啡誘導(dǎo)的PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為，上調(diào)了模型大鼠中腦黑質(zhì)Nfe2l2和Hmox-1 mRNA表達(dá)，抑制了Keap1蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠中腦黑質(zhì)Nfe2l2和Hmox-1 mRNA的代償性增加也達(dá)到了統(tǒng)計學(xué)意義，但Keap1蛋白表達(dá)無顯著性改變。結(jié)論：鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可改善PD肝陽上亢證大鼠的行為學(xué)改變，增加中腦黑質(zhì)Nfe2l2和Hmox-1 mRNA表達(dá)，抑制了Keap1蛋白表達(dá)，提示鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯抗PD的作用可能與其抗氧化作用有關(guān)。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯 旋轉(zhuǎn)行為 核因子E2相關(guān)因子2 肝陽上亢證 帕金森病

PD是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床癥狀主要為靜止性震顫、肌肉僵直、運動徐緩和姿勢步態(tài)異常。目前普遍認(rèn)為PD的發(fā)病與多種致病因素有關(guān)，其中腦組織脂質(zhì)過氧化促進(jìn)黑質(zhì)多巴胺（Dopamine，DA）能神經(jīng)元的變性是主要原因[1]。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯出自清代名醫(yī)張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，功用鎮(zhèn)肝熄風(fēng)，滋陰潛陽，是治療肝陽化風(fēng)證的經(jīng)典方。近年來，臨床應(yīng)用該方治療PD患者，對改善癥狀取得良好的臨床療效[2]，但其抗PD作用的機制尚未完全闡明。本研究采用附子湯灌胃聯(lián)合6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）偏側(cè)毀損制備PD肝陽上亢證大鼠模型，觀察鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對PD肝陽上亢證大鼠旋轉(zhuǎn)行為的改善作用，探討其可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性Wistar大鼠105只，體質(zhì)量220-240 g。由維通利華（北京）實驗動物科技有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 藥物

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯由懷牛膝（批號：130501）：代赭石（批號：30301）：生龍骨（批號：130501）：生牡蠣（批號：140301）：生龜板（批號：140701）：生白芍（批號：130401）：元參（批號：130601）：天冬（批號：13110）：川楝子（批號：140301）：生麥芽（批號：130501）：茵陳（批號：130201）：甘草（批號：130601）比例為60：60：30：30：30：30：30：30：12：12：12：9組 成。 水 煎2次后合并煎液，過濾濃縮（含生藥3.0 g·mL-1），飲片均購自哈爾濱市盛泰中藥飲片加工廠。附子湯由單味制附子組成，附子（批號：D4120201）購自黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司。其他藥物有：鹽酸司來吉蘭片（成都蓉藥集團(tuán)四川長威制藥有限公司，批號：20130902）、6-OHDA（美國Santa Cruz公司，批號：D2312）、Apomorphine（美國Cayman公司，批號：0458853-17）。

1.1.3 試劑

PrimeScript? RT Reagent kit（TaKaRa寶生物工程大連有限公司，批號：BK4001）、SYBR?Premix Ex Taq?（TakaRa寶生物工程大連有限公司，批號：AK2603），TRIzol?Reagent（批 號：47323） 購自Ambion公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列為：Nfe2l2 上游引物5'-CCCAGCACATCCAGACAGAC-3'，下 游 引 物5'-TATCCAGGGCAAGCGACTC-3'；Hmox-1上 游引物5'-TGCTCGCATGAACACTCTG-3'，下游引物5'-TCCTCTGTCAGCAGTGCCT-3'；Gapdh上游引物5'-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3'，下游引物R5'-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3'。細(xì)胞漿蛋白與核蛋白抽提試劑盒（南通碧云天公司，批號：P0028），顯光劑（美國Thermo公司，批號：PH203837），GAPDH抗體（美國Cell signaling公司，批號：8），Keap1抗體（美國Santa Cruz公司，批號：F2615），山羊二抗（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號：00161506）。

1.1.4 儀器

Stratagene Mx3005P實時熒光定量PCR儀（美國Agilent公司，型號：Mx3005P），S1000? Thermal Cycler（美國BIO-RAD公司，型號：S1000），江灣Ⅰ型C立體定向儀（第二軍醫(yī)大學(xué)，型號：I型C），微量進(jìn)樣器（上海高鴿工貿(mào)有限公司），XPE504精密分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型號：XPE504），ELX800全自動酶標(biāo)儀（美國BioTek公司，型號：ELX800），DXP-2大小鼠轉(zhuǎn)棒儀（醫(yī)科院藥研所，型號：DXP-2）。電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號：JY-ZY2、JY-CZ1），Smart Chemi?Image Analysis System（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，型號：SmartChemi 500）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥

大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、司來吉蘭組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低、中、高劑量組。制備PD肝陽上亢證大鼠病證結(jié)合模型：每天給予大鼠附子湯（2 g·kg-1）灌胃4周之后，1%的戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定于腦立體定位儀上。切開顱部皮膚，參照Paxions大鼠腦立體定位圖譜中黑質(zhì)組織的位置，在前囟后5.2 mm，矢狀縫右側(cè) 1.8 mm，硬膜下7.6 mm；采用微量進(jìn)樣器注射6-OHDA溶液2 μL（4 μg·μL-1）后縫合皮膚，假手術(shù)組注射等量生理鹽水溶液。司來吉蘭組每天給予劑量為0.9 mg·kg-1、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低劑量組每天給予劑量為8 g·kg-1、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯中劑量組每天給予劑量為16 g·kg-1、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯高劑量組每天給予劑量為32 g·kg-1，每組大鼠連續(xù)灌胃給藥28天。正常對照組、假手術(shù)組和模型組大鼠給予生理鹽水灌胃。

1.2.2 大鼠平衡能力檢測

將大鼠置于旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)棒儀上，檢測從轉(zhuǎn)棒跌落下來的時間（即運動潛伏期）。

1.2.3 阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為評價

大鼠腹腔內(nèi)注射阿樸嗎啡（0.5 mg·kg-1）10 min后，開始觀察并記錄大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，表現(xiàn)為以對側(cè)的前肢或后肢為支撐點，向損傷對側(cè)旋轉(zhuǎn)，頭尾相接，身體彎曲成環(huán)狀的快速旋轉(zhuǎn)行為，共記錄30 min。

1.2.4 Real-time PCR檢測Nfe2l2和Hmox-1 mRNA表達(dá)

取大鼠中腦黑質(zhì)組織，采用TRIzol?Reagent法提取總RNA。cDNA的合成按照PrimeScript? RT試劑盒說明書進(jìn)行，采用SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒分析Ct值，以2-ΔΔCt方法計算Nfe2l2和Hmox-1 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blot法檢測核Keap1蛋白表達(dá)

在冰上取大鼠中腦黑質(zhì)組織，采用蛋白抽提試劑盒提取漿蛋白。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉后，加入Keap1抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，孵育，洗膜，用ECL法顯光后采用Smart Chemi? Image Analysis System進(jìn)行分析。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯改善PD肝陽上亢證模型大鼠運動行為損傷

大鼠平衡能力檢測和阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為評價結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，PD肝陽上亢證模型組大鼠運動潛伏期顯著減少，而30 min旋轉(zhuǎn)次數(shù)顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯高、中、低劑量組和司來吉蘭組大鼠運動潛伏期顯著增加，而30 min旋轉(zhuǎn)次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。與司來吉蘭組比較，高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組大鼠運動潛伏期和旋轉(zhuǎn)次數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對PD肝陽上亢證模型大鼠運動行為損傷的影響見圖1。

2.2 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯上調(diào)了PD肝陽上亢證模型大鼠中腦黑質(zhì)Nfe2l2 mRNA表達(dá)

PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，PD肝陽上亢證模型組大鼠中腦黑質(zhì)Nfe2l2 mRNA表達(dá)代償性增加（P＜0.05）。與模型組比較，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低、中、高劑量組大鼠中腦黑質(zhì)Nfe2l2 mRNA表達(dá)均顯著性增加（P＜0.05）。司來吉蘭對PD肝陽上亢證模型大鼠中腦黑質(zhì)Nfe2l2 mRNA表達(dá)無顯著性影響（P＞0.05）。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對PD肝陽上亢證模型大鼠中腦黑質(zhì)Nfe2l2 mRNA表達(dá)的影響見圖2。

2.3 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯誘導(dǎo)了PD肝陽上亢證模型大鼠中腦黑質(zhì)Hmox-1 mRNA表達(dá)

PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，PD肝陽上亢證模型組大鼠中腦黑質(zhì)Hmox-1 mRNA表達(dá)代償性增加（P＜0.05）。與模型組比較，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低、中、高劑量組大鼠中腦黑質(zhì)Hmox-1 mRNA表達(dá)均顯著性增加（P＜0.05）。司來吉蘭對PD肝陽上亢證模型大鼠中腦黑質(zhì)Hmox-1 mRNA表達(dá)無顯著性影響（P＞0.05）。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對PD肝陽上亢證模型大鼠中腦黑質(zhì)Hmox-1 mRNA表達(dá)的影響見圖2。

2.4 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯抑制了PD肝陽上亢證模型大鼠中腦黑質(zhì)Keap1蛋白表達(dá)

Western blot顯示，與假手術(shù)組比較，PD肝陽上亢證模型組大鼠中腦黑質(zhì)Keap1蛋白表達(dá)無顯著性變化（P＞0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組大鼠中腦黑質(zhì)Keap1蛋白表達(dá)均顯著性降低（P＜0.05）。司來吉蘭對PD肝陽上亢證模型大鼠中腦黑質(zhì)Keap1蛋白表達(dá)無顯著性影響（P＞0.05）。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對PD肝陽上亢證模型大鼠中腦黑質(zhì)Keap1蛋白表達(dá)的影響見圖3。

圖1 各組大鼠運動行為損傷的比較

3 討論

附子為辛、甘、大熱之品，灌服附子湯能灼傷大鼠的肝腎之陰而導(dǎo)致其肝陽上亢。本文采用在肝陽上亢證候模型基礎(chǔ)上再施加6-OHDA單側(cè)損毀PD模型誘導(dǎo)因素，通過該復(fù)合因素法建立的模型能較好地體現(xiàn)“病”與“證”各方面的特征。本文觀察到附子湯灌胃聯(lián)合6-OHDA偏側(cè)毀損制備帕金森病肝陽上亢證模型大鼠的易激惹程度（“狂躁易怒”癥狀）和結(jié)膜充血（“目赤”癥狀）顯著增加，與人類肝陽上亢證臨床表現(xiàn)相近似。PD肝陽上亢證大鼠在阿樸嗎啡誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯的旋轉(zhuǎn)行為，與PD患者的行為學(xué)相似，因此，本文認(rèn)為附子湯灌胃聯(lián)合6-OHDA偏側(cè)毀損制備PD肝陽上亢證動物模型是可行的。

6-OHDA是一種親神經(jīng)毒性物質(zhì)，可被DA能神經(jīng)元主動攝取到細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)氧化生成羥自由基和醌類等神經(jīng)毒性物質(zhì)，特異性破壞含DA的神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致PD樣改變，6-OHDA成為公認(rèn)的制備PD動物模型的神經(jīng)毒[3]。阿樸嗎啡是外源性DA受體激動劑，能誘導(dǎo)PD模型大鼠的旋轉(zhuǎn)行為[4]。通過觀察阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，可以對PD的損傷程度進(jìn)行量化，作為評價藥物治療作用的指標(biāo)之一[5]。本實驗結(jié)果表明，PD肝陽上亢證大鼠在阿樸嗎啡誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯的旋轉(zhuǎn)行為，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯干預(yù)4周后，則能顯著改善PD大鼠的行為異常，從而推測鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對DA神經(jīng)元具有一定保護(hù)作用。

圖2 各組大鼠中腦黑質(zhì)Nfe2l2和Hmox-1 mRNA表達(dá)的差異。

圖3 各組大鼠中腦黑質(zhì)Keap1蛋白表達(dá)的變化

血紅素氧合酶是一種廣泛存在的抗氧化防御酶，HO-1屬微粒體酶，是誘導(dǎo)型的血紅素加氧酶，凡引起細(xì)胞活性氧類水平增加的外來刺激，如：MPP+和6-OHDA，大都能使HO-1的表達(dá)增加[6,7]。作為可誘導(dǎo)應(yīng)激蛋白，HO-1已被廣泛認(rèn)為是氧化應(yīng)激中一種高度敏感和可靠的指標(biāo)[8]。PD是一種多病因?qū)е碌睦夏晖诵行约膊?，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激是PD發(fā)病的核心因素，抗氧化治療是治療PD有效的方案之一[9]。正常生物體內(nèi)存在著HO-1等抗氧化酶，通過抗氧化以及清除多余的自由基對機體起保護(hù)作用[10]。

6-OHDA引起神經(jīng)損傷的主要原因是毒素引起的氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激能夠破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。研究表明，使用中藥及其活性成分作為誘導(dǎo)劑，產(chǎn)生內(nèi)源性抗氧化劑和Ⅱ相抗氧化解毒酶是防止DA神經(jīng)元氧化應(yīng)激的一個重要策略[12]。本實驗結(jié)果表明，6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠中腦黑質(zhì)Hmox-1 mRNA代償性增加，而鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯干預(yù)顯著的提高了大鼠中腦黑質(zhì)Hmox-1 mRNA表達(dá)，表明鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯能提高PD肝陽上亢證模型大鼠的抗氧化能力。

通過激活細(xì)胞的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)來改善氧化損傷，近年來倍受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注[13]。Nrf2通過激活抗氧化反應(yīng)元件，啟動細(xì)胞內(nèi)的抗氧化通路，清除活性氧，被認(rèn)為是調(diào)控多種抗氧化酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的關(guān)鍵內(nèi)源性通路[14]，Nrf2是調(diào)控HO-1表達(dá)的關(guān)鍵上游轉(zhuǎn)錄因子[15]。Nrf2敲除的小鼠神經(jīng)元更易受MPTP損傷[16]。藥理學(xué)途徑激活Nrf2可以在體內(nèi)或體外抑制6-OHDA、MPP+以及MPTP引起的神經(jīng)元損傷[17-19]。在PD發(fā)病過程中，DA神經(jīng)元中Nrf2的表達(dá)上調(diào)，這可能是神經(jīng)元對氧化應(yīng)激的代償性反應(yīng)[20]。本文發(fā)現(xiàn)，PD肝陽上亢證模型組大鼠中腦黑質(zhì)Nfe2l2 mRNA表達(dá)代償性增加。肝熄風(fēng)湯組大鼠中腦黑質(zhì)Nfe2l2 mRNA表達(dá)進(jìn)一步顯著性增加。同時，肝熄風(fēng)湯組大鼠中腦黑質(zhì)Keap1蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步促進(jìn)了Nfe2l2核轉(zhuǎn)位。

綜上所述，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可能通過上調(diào)PD肝陽上亢證大鼠中腦黑質(zhì)核Nfe2l2表達(dá)和抑制Keap1蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)Hmox-1轉(zhuǎn)錄，抑制PD肝陽上亢證模型大鼠中腦黑質(zhì)氧化應(yīng)激，進(jìn)而改善運動行為損傷。

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Abstract:The aim of this study was to explore the effects of ZGXF decoction on amphetamine-induced rotation in PD rats with syndrome of liver-yang hyperactivity, and its mechanism involved. Rats received 6-OHDA administration via intra-substantia nigra injection and were intragastrically treated by Fu Zi decoction to establish the PD model with the syndrome of liver-yang hyperactivity. Three doses of ZGXF decoction or selegiline were given by a 28-day intragastric administration. The rats were tested for amphetamine-induced rotation asymmetry. In addition, real-time PCR were adopted to analyze the expressions of Nfe2l2 and Hmox-1 mRNAs, while western blot to analyze the expression of Keap1 protein. As a result, it was found that ZGXF decoction dose-dependently attenuated amphetamine-induced rotation, up-regulated the expressions of Nfe2l2 and Hmox-1 mRNAs, and down-regulated the expression of Keap1 protein in the substantia nigra in PD rats with syndrome of liver-yang hyperactivity. It was suggested that anti-PD effects of ZGXF decoction be attributed to the up-regulation of Nfe2l2 and Hmox-1 mRNAs and the down-regulation of Keap1 protein, being associated with oxidative stress, in the substantia nigra of PD rats with syndrome of liver- yang hyperactivity.

Effects of Zhen Gan Xi Feng (ZGXF) Decoction on Amphetamine-Induced Rotation in Rats with Parkinson’s Disease (PD) with the Syndrome of Liver-Yang Hyperactivity

Li Xiaoming1, Zhang Lihua2, Qi Yanqiu2, Sun Ying2, Zhu Lanqin2, Dong Miaoxian2
(1. The Institute of Medicine, Qiqihar Medical Univeristy, Qiqihar 161006, China;2. Health Center, Qiqihar Medical Univeristy, Qiqihar 161006, China)

Zhen Gan Xi Feng decoction, rotation behavior, transcription factor NF-e2-related factor 2, syndrome of liver-yang hyperactivity, Parkinson's disease

10.11842/wst.2016.12.019

R2-031

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-09-21

修回日期：2016-11-04

＊ 國家自然科學(xué)基金委面上項目（81373629）：基于PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的鎮(zhèn)肝熄風(fēng)法抑制帕金森病氧化應(yīng)激損傷的機制研究，負(fù)責(zé)人：董妙先。

＊＊ 通訊作者：董妙先，主任醫(yī)師，主要研究方向：中藥藥理學(xué)研究。