南蛇藤提取物對(duì)過表達(dá)mTOR的人肝癌HepG2細(xì)胞株的影響＊

錢亞云，陸松花，趙雪煜，楊 婷，史有陽，金 鳳，劉延慶

（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 揚(yáng)州 225009）

南蛇藤提取物對(duì)過表達(dá)mTOR的人肝癌HepG2細(xì)胞株的影響＊

錢亞云＊＊，陸松花，趙雪煜，楊 婷，史有陽，金 鳳，劉延慶

（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 揚(yáng)州 225009）

目的：構(gòu)建過表達(dá)雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）的人肝癌HepG2細(xì)胞，并研究中草藥南蛇藤Celastrus orbiculatus Thunb.提取物對(duì)該細(xì)胞的影響。方法：利用分子生物學(xué)技術(shù)，將GV238-mTOR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞，分別用熒光素酶活性檢測(cè)和Western Blot實(shí)驗(yàn)，分析轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中mTOR的表達(dá)水平。人肝癌HepG2/mTOR++細(xì)胞中，加入不同濃度的南蛇藤提取物（20、40、80、160、320 μg·mL-1）作用24 h后，分析南蛇藤提取物對(duì)mTOR蛋白的作用。結(jié)果：經(jīng)轉(zhuǎn)染的人肝癌HepG2細(xì)胞中，mTOR蛋白的表達(dá)水平顯著增加。南蛇藤提取物明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并明顯降低細(xì)胞內(nèi)mTOR蛋白的表達(dá)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功獲得能穩(wěn)定過表達(dá)mTOR的人肝癌HepG2細(xì)胞株。南蛇藤提取物明顯抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)mTOR蛋白的表達(dá)水平。

南蛇藤 肝癌 過表達(dá) 雷帕霉素靶蛋白

哺乳動(dòng)物mTOR也稱雷帕霉素相關(guān)蛋白（Rapamycin-Associated Protein, FKBP），是磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶蛋白家族成員，屬非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究發(fā)現(xiàn)mTOR參與體內(nèi)多條信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞的增殖、分化、自噬等環(huán)節(jié)具有中心調(diào)控作用[1]。臨床肝癌手術(shù)標(biāo)本中mTOR的表達(dá)量與肝癌的惡性程度及不良轉(zhuǎn)歸呈正相關(guān)[2]。這些結(jié)果提示mTOR可能是藥物治療肝癌的潛在靶點(diǎn)之一。為了研究mTOR在肝癌中的作用，本課題組構(gòu)建了能穩(wěn)定過表達(dá)mTOR的人肝癌HepG2細(xì)胞，并研究了中草藥南蛇藤提取物對(duì)該細(xì)胞株的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

人肝癌細(xì)胞株HepG2，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。帶有熒光素酶報(bào)告基因的載體GV238（元件順序MCS-Luc），本實(shí)驗(yàn)室自備。限制性內(nèi)切酶MluI和BglII、T4 DNA Ligation Kit購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。梭華-Sofast基因轉(zhuǎn)染盒購(gòu)自廈門太陽馬生物工程有限公司。

1.2 藥物

南蛇藤提取物提取方法如前所述[5,6]，現(xiàn)簡(jiǎn)述如下。南蛇藤購(gòu)自廣州致信藥業(yè)有限公司，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)中藥資源研究室秦民堅(jiān)教授鑒定為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物。將南蛇藤莖切斷、粉碎成粉，烘干（15 kg），用95%乙醇（150 L）提取3 h，重復(fù)3次，合并提取液，回收乙醇，浸膏（900 g）加水分散后，石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯層，水洗滌3次，減壓濃縮，真空凍干，得南蛇藤莖乙酸乙酯提取物（250 g），貯存于4℃。每1 g提取物相當(dāng)于60 g生藥，使用前以DMSO助溶。

1.3 RT-PCR檢測(cè)mTOR mRNA表達(dá)

按GeneBank中mTOR（NM_004958）啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)引物。上游引物P1：5’-ATCGACGCG TACTTACATTGTTGCACAACTTG-3’；下游引物P2：5’-CCGAAGATCTCTTCGGCCAAGGCCTCAGCT GC-3’，引物中包含交換配對(duì)堿基、酶切位點(diǎn)以及目的基因中5’端部分調(diào)取基因。RT-PCR擴(kuò)增目的基因片段，20 μL總反應(yīng)體系，反應(yīng)參數(shù)設(shè)為：94℃5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)后72℃ 10 min。PCR鑒定陽性克隆，上游引物P3：5’-CGGCATCGCTCACATTCT-3’；下游引物P4：5’-TGGAAGACGCCAAAAACATAAAG-3’，20 μL總反應(yīng)體系，設(shè)定程序94℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)后72℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 過表達(dá)mTOR載體的構(gòu)建

載體GV238和含有mTOR啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物，分別以限制性內(nèi)切酶MluI和BglII雙酶切，連接兩種純化后的酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，挑克隆，雙酶切和PCR方法初步篩選并進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性檢測(cè)

對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞（約4×105），接種于24孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為80%。嚴(yán)格按轉(zhuǎn)染試劑盒要求，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性檢測(cè)。步驟簡(jiǎn)述如下，將轉(zhuǎn)染緩沖液按比例加入質(zhì)粒中（2 μL緩沖液：0.6 μg質(zhì)粒），室溫靜置20 min后，將該混合液加入HepG2細(xì)胞中，于孵箱中培養(yǎng)48 h，室溫下加入裂解液反應(yīng)10 min，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶相對(duì)熒光值，進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和分析。

1.6 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，提取總蛋白，以改良型Lowry 法測(cè)定蛋白樣品濃度。所得蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗（1：1 000），4℃過夜，再加二抗（1：4 000）室溫孵育2 h，ECL顯影，進(jìn)行圖像采集并分析。

1.7 MTT試驗(yàn)

取96孔板，收集對(duì)數(shù)期HepG2/mTOR++細(xì)胞，調(diào)整濃度為103-104個(gè)/孔，以無血清培養(yǎng)基孵育12 h后，棄上清。加入不同濃度（20、40、80、160或320 μg·mL-1）的COE（以無血清培養(yǎng)基配置），陽性藥物為2 μg·mL-1的DDP。每種濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。以含2%FBS的RPMI 1640維持培養(yǎng)基孵育16-48 h。每孔加入20 μL MTT溶液（5 μg·mL-1，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)上清。每孔加入DMSO 150 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于OD 490 nm處測(cè)量各孔吸光值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組載體的構(gòu)建及鑒定

利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增出長(zhǎng)約2 114 bp的mTOR啟動(dòng)子區(qū)的片段（圖1）。將PCR產(chǎn)物及GV238載體分別用MluI和BglII進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，挑取重組體用PCR和雙酶切反應(yīng)進(jìn)行初步鑒定，獲得大小合適的片段（約為562 bp，圖2），表明獲得GV238 - mTOR重組質(zhì)粒。

圖1 mTOR啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 重組克隆PCR鑒定產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖3 WB檢測(cè)mTOR蛋白表達(dá)水平

圖4 熒光素酶相對(duì)活性檢測(cè)

2.2 重組載體的測(cè)序

接種陽性轉(zhuǎn)化子，37℃培養(yǎng)16 h后保存為甘油菌，分裝200 μL，雙向測(cè)序，經(jīng)NCBI-BLAST比對(duì)分析，mTOR啟動(dòng)子基因序列與GeneBank登錄的mTOR（NM_004958）序列完全同源性高達(dá)99%，表明已成功構(gòu)建GV238-mTOR重組子。

2.3 Western Blot檢測(cè)mTOR蛋白表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染GV238-mTOR重組質(zhì)粒的人肝癌HepG2細(xì)胞，提取總蛋白，Western Blot檢測(cè)mTOR蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果如圖3所示，與野生型人肝癌HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染GV238-mTOR重組質(zhì)粒的人肝癌HepG2（記作HepG2 / mTOR++細(xì)胞）中，mTOR蛋白的表達(dá)水平明顯增加。

2.4 熒光素酶相對(duì)活性檢測(cè)

將GV238空載體質(zhì)粒和GV238-mTOR重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞，24 h后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的相對(duì)熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染GV238空載體質(zhì)粒的陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染GV238-mTOR重組質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（P＜0.01），表明成功構(gòu)建高表達(dá)mTOR的人肝癌HepG2細(xì)胞株。

2.5 南蛇藤提取物對(duì)HepG2/mTOR++細(xì)胞株的影響

以MTT試驗(yàn)分析南蛇藤提取物對(duì)HepG2/ mTOR++細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果如圖5所示，與未加藥組相比，藥物作用24 h，南蛇藤提取物明顯抑制HepG2/mTOR++肝癌細(xì)胞的增殖（P＜0.05），并具有時(shí)間濃度依賴性。同時(shí)，計(jì)算南蛇藤提取物IC50約136.13 μg·mL-1。

2.6 南蛇藤提取物對(duì)mTOR蛋白的影響

將HepG2/mTOR++細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入不同濃度的南蛇藤提取物，并以mTOR蛋白的抑制劑Rapamycin作為陽性對(duì)照藥物，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mTOR蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖6所示，南蛇藤提取物明顯抑制細(xì)胞內(nèi)mTOR蛋白的表達(dá)。

3 討論

目前，干擾細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的技術(shù)主要有腺病毒感染[3]、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）基因敲除[4]等，需要根據(jù)目的蛋白的分子量大小和特性選擇合適的方法。mTOR蛋白分子量大（289 kDa），不易包裝成腺病毒，因此，本實(shí)驗(yàn)室選擇運(yùn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)的人肝癌HepG2細(xì)胞株。腫瘤細(xì)胞中mTOR分子大量表達(dá)，可誘導(dǎo)酪氨酸激酶磷酸化，活化下游src、PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，激活EMT[7]，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。也有研究者發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR的異常激活，也與腫瘤干細(xì)胞的表型[8]密切相關(guān)。因此，研究mTOR信號(hào)通路可以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)機(jī)體的各種生理功能，為腫瘤的治療提供新思路。

圖5 南蛇藤提取物對(duì)HepG2/mTOR++細(xì)胞增殖能力的影響

圖6 WB檢測(cè)mTOR蛋白表達(dá)水平

很多中草藥提取物具有多靶點(diǎn)抗腫瘤[9,10]作用，并且副作用較小。南蛇藤在中國(guó)分布甚廣，藥用價(jià)值始載于清代《植物名實(shí)圖考》。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤提取物不僅能抑制肝癌的生長(zhǎng)和血管生成，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞特異性抗腫瘤的細(xì)胞免疫功能；而且能在一定程度上逆轉(zhuǎn)人肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[5]（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）過程。初步分析南蛇藤提取物抗癌的分子機(jī)制，可能與mTOR[6]信號(hào)通路相關(guān)。為了探討南蛇藤提取物能否抑制肝癌細(xì)胞中mTOR的表達(dá)，本研究構(gòu)建了HepG2/mTOR++細(xì)胞株，并發(fā)現(xiàn)南蛇藤提取物呈濃度依賴性地抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，降低mTOR的表達(dá)水平。但南蛇藤提取物是否通過靶向mTOR逆轉(zhuǎn)EMT，還需要分析藥物作用與EMT標(biāo)記蛋白（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）的表達(dá)水平之間的相關(guān)性。另外，還需要建立用RNAi沉默表達(dá)mTOR的HepG2肝癌細(xì)胞模型，以不同濃度的南蛇藤總萜干預(yù)，系統(tǒng)研究南蛇藤總萜靶向mTOR通路抑制肝癌細(xì)胞EMT的分子機(jī)制。同時(shí)，課題組還會(huì)建立原位/尾靜脈接種的肝癌裸鼠模型，通過分子示蹤技術(shù)，動(dòng)態(tài)觀察南蛇藤總萜對(duì)肝癌移植瘤生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移能力的影響。

下一步研究，擬對(duì)南蛇藤提取物通過靶向mTOR抑制肝癌EMT的具體分子信號(hào)通路，進(jìn)行更深入的探討。

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4 張文美,丁妍,郭興榮,等. TALEN介導(dǎo)的CXCR4敲除肝癌細(xì)胞株的建立.生物技術(shù)通報(bào),2016,32(2)：225-228.

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Effects of Celastrus orbiculatus Thunb. Extract on the Overexpression of mTOR in Human HepG2 Cells

Qian Yayun, Lu Songhua, Zhao Xueyu, Yang Ting, Shi Youyang, Jin Feng, Liu Yanqing
(Medical College, Yangzhou University, Yangzhou 225003, China)

This study aimed at investigating the effects of the extract of Chinese herb, Nansheteng (C. orbiculatus Thunb.), on human HepG2 cells through the overexpression of mTOR. The GV238-mTOR recombinant plasmids were transfected into HepG2 cells using molecular biological technology. The expression level of mTOR was evaluated by means of relative activity of luciferase and western blot. Human hepatic carcinoma HepG2/mTOR++cells were treated with C. orbiculatus extract in different concentrations (20, 40, 80, 160 and 320 μg·mL-1) for 24 h. The mTOR protein expression was detected by western blot. It was found that the protein expression of mTOR in transfected HepG2 cells was significantly enhanced. C. orbiculatus extract significantly inhibited the proliferation of HepG2/mTOR++cells. Simultaneously, C. orbiculatus extract inhibited mTOR at its protein level in a dose-dependent manner. In conclusion, we successfully constructed recombinant mTOR cloning vectors, and established the stable HepG2 cell line with the overexpression of mTOR. Besides, C. orbiculatus extract significantly inhibited mTOR protein expression in human hepatic carcinoma HepG2 cells.

Celastrus orbiculatus Thunb., hepatic carcinoma, overexpression, mammalian target of rapamycin

10.11842/wst.2016.12.018

R285.5

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-10-17

修回日期：2016-11-29

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委青年基金項(xiàng)目（81403232）：南蛇藤提取物靶向PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制肝癌早期轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：錢亞云；國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81274141）：南蛇藤總萜通過協(xié)同抑制Notch和VEGF的表達(dá)阻斷肝癌血管生成的作用機(jī)制，負(fù)責(zé)人：劉延慶；江蘇省自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（BK2012686）：南蛇藤提取物增強(qiáng)抑癌基因MASPIN表達(dá)抑制胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：錢亞云；教育部博士點(diǎn)基金新教師類項(xiàng)目（20133250120003）：南蛇藤總萜靶向mTOR信號(hào)通路抑制肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：錢亞云。

＊＊ 通訊作者：錢亞云，副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合抗腫瘤研究。