循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測在膀胱癌中的應(yīng)用

嚴(yán)勇 孫洵 王劍松

·綜述·

循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測在膀胱癌中的應(yīng)用

嚴(yán)勇 孫洵 王劍松

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球惡性腫瘤中居第九位[1]，在我國泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率及死亡率均居首位[2]。膀胱癌多數(shù)以浸潤方式生長，首次治療后復(fù)發(fā)率高，約50%～70%，但目前仍無確切的可應(yīng)用于臨床的血清標(biāo)志物來監(jiān)測膀胱癌的復(fù)發(fā)、進(jìn)展與轉(zhuǎn)移，而應(yīng)用影像學(xué)檢查并不能早期發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，因此近50%的肌層浸潤性膀胱癌在臨床確診時(shí)已有微轉(zhuǎn)移灶[3]?；诖?，臨床急需一種能早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶的檢測方法，以期早期發(fā)現(xiàn)膀胱癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，并據(jù)此制定有針對性的個(gè)體化治療方案，從而降低膀胱癌的復(fù)發(fā)率，改善治療效果及提高患者生存率。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTC)是由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞，大多數(shù)被機(jī)體清除，少數(shù)存活，與原發(fā)腫瘤具有類似的抗原、遺傳性，是腫瘤血行轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。對比于影像學(xué)檢查，CTC數(shù)量的改變明顯早于影像學(xué)檢查的改變[4]，因此可應(yīng)用于膀胱癌早期微轉(zhuǎn)移灶的監(jiān)控和檢測，并有望為膀胱癌的診斷、分期、治療提供重要依據(jù)。本文結(jié)合近年的文獻(xiàn)，就CTC檢測及其在膀胱癌中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述。

一、CTC的分型

CTC是痕量存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，因自發(fā)或診療操作從實(shí)體腫瘤病灶脫落，大部分CTC進(jìn)入外周血后被吞噬或凋亡，存活的CTC僅占外周血白細(xì)胞的1/106～107[5]，這些CTC在惡性腫瘤血行轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[6]。腫瘤細(xì)胞的侵襲性和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)有關(guān)，即發(fā)生了上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)，因此，CTC分為上皮型CTC、混合型CTC和間質(zhì)型CTC。上皮型CTC通過自身分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶使得遷移能力增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)型CTC，從而播散、遷移能力更強(qiáng)[7]，間質(zhì)型CTC主要是腫瘤細(xì)胞通過修飾自身形態(tài)及骨架結(jié)構(gòu)、黏附分子，使黏附能力下降、可塑性增強(qiáng)，易于脫落。最終，間質(zhì)型CTC具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛能[8]。據(jù)此，可通過分型檢測CTC不同表型來判斷腫瘤細(xì)胞侵襲能力，從而確定腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移可能性;而原發(fā)部位腫瘤細(xì)胞與CTC的基因表達(dá)譜又不同,因此，今后還可以檢測CTC的基因表達(dá)譜，以確定腫瘤的原發(fā)部位或轉(zhuǎn)移部位，對腫瘤診斷及個(gè)體化治療具有重要意義。

二、CTC的檢測

從外周采集血液取材方便、侵襲性小，采集血液后濃縮聚集含有極少數(shù)CTC的血細(xì)胞，檢測出CTC并與其他細(xì)胞鑒別，最后確定CTC分子特征，即完成了CTC的檢測。目前CTC常用的檢測方法分為富集、分選類和鑒別、分析類等。富集、分選類是利用細(xì)胞的理化特性將其特異性富集，以提高檢測的敏感性，其中包括基于細(xì)胞密度的梯度離心法、基于細(xì)胞大小的膜濾過法等，梯度離心法利用CTC與白細(xì)胞的密度、沉降系數(shù)不同，進(jìn)行梯度離心法分離，相比于基于上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗體的免疫磁珠分離法，得到的CTC中含有EpCAM陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞，因此，EpCAM陰性細(xì)胞沒有遺漏，但靈敏度及特異性稍低[9]；基于細(xì)胞大小的膜濾過法是利用CTC直徑顯著大于白細(xì)胞，通過聚碳酸酯膜將CTC與血細(xì)胞分離，即使腫瘤表面標(biāo)志物改變也能檢出，其靈敏度高，在前列腺癌、乳腺癌患者中，本法CTC的檢出率較CellSearch系統(tǒng)要高[10]，且能檢測出CellSearch系統(tǒng)無法檢測的CTC細(xì)胞團(tuán)形成的微栓子，檢出的CTC能應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、基因檢測等。但基于細(xì)胞大小的膜濾過法不適于體積小或具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞檢測[11]。鑒別、分析類是利用腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物、基因轉(zhuǎn)錄水平來檢測出CTC，包括流式細(xì)胞術(shù)、CTC芯片技術(shù)、RT-PCR及CellSearch 系統(tǒng)等，其中CellSearch 系統(tǒng)是目前唯一通過美國食品藥品管理局(FDA)認(rèn)證可用于臨床的CTC檢測方法，主要是應(yīng)用包被了EpCAM抗體的免疫磁珠來檢測出CTC，但在一些腫瘤細(xì)胞發(fā)生了EMT時(shí)會(huì)丟失抗原，發(fā)生漏檢，且其價(jià)格昂貴，臨床較難普及；流式細(xì)胞術(shù)是應(yīng)用熒光標(biāo)記相應(yīng)抗體檢測CTC，其操作簡便、快速、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，特異性高、可重復(fù)性好，費(fèi)用低，可應(yīng)用于臨床普查，但敏感度低，其檢測出的細(xì)胞不能進(jìn)行后期的細(xì)胞培養(yǎng)、基因檢測等；CTC芯片技術(shù)簡便可行，是基于微流體學(xué)的檢測技術(shù)，在芯片上預(yù)置包被EpCAM抗體的顯微位點(diǎn)來檢測CTC，并且能捕獲到CTC 細(xì)胞團(tuán)，總體捕獲率可達(dá)95%～99%[12]，適于推廣；RT-PCR具有較高的假陽性率，應(yīng)用較少。綜合上述檢測方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此，選擇兩種或多種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可以明顯提高CTC檢測的特異性和敏感性。CanPatrol富集技術(shù)即是結(jié)合了免疫磁珠法和膜濾過法來檢測CTC，其不需要依賴特異性抗體，白細(xì)胞去除率為99.9%，腫瘤細(xì)胞回收率>80%[13]，且能收集到各種表型的CTC及CTC細(xì)胞團(tuán)，收集的CTC細(xì)胞還能用于細(xì)胞培養(yǎng)、免疫熒光劑基因檢測等，值得臨床推廣。而目前關(guān)于檢測膀胱癌患者CTC的報(bào)道較少，其中，國外多采用CellSearch系統(tǒng)，國內(nèi)多采用免疫芯片分選法等，依據(jù)其自身檢測原理均能檢測出CTC，且陽性率均不低，提示膀胱癌患者也能較好地應(yīng)用CTC檢測來監(jiān)測疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況。

三、CTC檢測在臨床膀胱癌中的應(yīng)用

目前，有較多關(guān)于CTC檢測與多種腫瘤包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移關(guān)系緊密的報(bào)道，提示CTC檢測對其診斷、分期、治療均能提供重要依據(jù)[14-16]。但CTC檢測在臨床膀胱癌中的應(yīng)用報(bào)道相對較少。

1.膀胱癌的診斷和分期：膀胱癌微轉(zhuǎn)移灶的早期診斷和干預(yù)對患者的預(yù)后極為重要，雖然目前有血清學(xué)的腫瘤標(biāo)志物和高分辨率的影像學(xué)檢查，但因缺乏特異性的血清標(biāo)志物及顯微影像學(xué)觀察，仍無法做到早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶及對疾病的精準(zhǔn)監(jiān)測。而目前膀胱癌的CTC檢測，一般為采集病理確診的患者外周靜脈血送檢，因外周血CTC數(shù)目極少，濃集后每1×106～1×109個(gè)正常細(xì)胞才能檢測出一個(gè)CTC，因此，一個(gè)及以上的CTC檢出即視為進(jìn)入循環(huán)的膀胱癌細(xì)胞，視為陽性。有研究表明，曾有臨床≤Ⅱ期的膀胱癌患者，治療前檢測出CTC，治療后確定為Ⅲ期，甚至Ⅳ期，提示術(shù)前臨床分期過低，因此，CTC的檢測不僅能作為膀胱癌的診斷依據(jù)之一，還能作為非肌層浸潤性膀胱癌與肌層浸潤性膀胱癌的重要鑒別指標(biāo)[17]。而另一項(xiàng)研究指出，術(shù)前CTC的檢出以及CTC數(shù)量的多少與根治術(shù)后膀胱癌的病理分期無明顯相關(guān)性[18]。目前的研究表明，CTC與膀胱癌的TNM分期有一定關(guān)聯(lián)，特別是與T分期具有相關(guān)性[19]，但未發(fā)現(xiàn)與N及M分期的相關(guān)性[20]，因此，目前CTC檢測還不能作為膀胱癌分期的指南性指標(biāo)，僅能作為分期的參考，CTC的檢出不是直接預(yù)示了腫瘤的高分期，而僅是提示了高危膀胱癌，高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移率，從而對治療提供積極的指導(dǎo)意見。

2.膀胱癌的治療及療效監(jiān)測：雖然不斷有細(xì)胞角蛋白等新的腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物的出現(xiàn)，但目前仍無一種特異性的膀胱癌血清標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，因此，膀胱癌的治療仍陷于程序化，缺乏個(gè)體化的治療，缺乏關(guān)鍵的關(guān)于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的治療反饋和療效監(jiān)測手段。而已有大宗的前瞻性研究表明，膀胱癌治療后即使是僅有一個(gè)CTC的檢出，均標(biāo)志著腫瘤復(fù)發(fā)率、癌癥相關(guān)病死率高以及總生存率低，預(yù)后較差[21]。因此，CTC的檢測可預(yù)期對于臨床膀胱癌的治療具有極好的指導(dǎo)意義。現(xiàn)有的各種檢測方法均是檢測出一個(gè)及以上的CTC即為陽性，但鑒于不同檢測方法敏感性及特異性不一致，目前傾向于聯(lián)合應(yīng)用多種技術(shù)檢測，最終達(dá)到統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法。對于局限性膀胱癌而CTC陽性的患者通過局部治療往往不足以達(dá)到根治的目的，可密切隨訪，或應(yīng)用輔助化療或新輔助化療；對于CTC數(shù)量多或多發(fā)間質(zhì)型CTC或CTC細(xì)胞團(tuán)的患者，結(jié)合分期，傾向于根治術(shù)結(jié)合輔助化療，從而減少復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，使患者在總生存率及無病生存率方面獲益。另一方面，由于指南認(rèn)為膀胱癌根治術(shù)有最佳治愈可能，臨床上有不少患者處于過度治療，而通過CTC的篩查、監(jiān)測，有望對治療進(jìn)行實(shí)時(shí)指導(dǎo)，減少膀胱切除率，提高患者生活質(zhì)量，而不影響患者的總體生存率。對于CTC數(shù)量、表型的變化和表面生物學(xué)分子的分析，有利于治療療效的評價(jià)及指導(dǎo)個(gè)體化靶向治療；對于CTC的基因表達(dá)及突變情況的實(shí)時(shí)檢測，能判斷腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的耐藥性，從而及時(shí)調(diào)整藥物，監(jiān)測、提高療效。

3.膀胱癌的預(yù)后：膀胱癌的預(yù)后與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，Rink等[22]在50例局限性膀胱癌患者外周血中檢測出CTC陽性15例(30%)，對CTC陽性和CTC陰性患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，二者在總體生存率、無進(jìn)展生存率和癌特異性生存率方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CTC陽性患者進(jìn)展、轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后差。隨后又應(yīng)用CellSearch系統(tǒng)進(jìn)一步研究了100例局限性膀胱癌患者，術(shù)前CTC陽性率為23%，隨訪發(fā)現(xiàn)CTC陽性患者具有更高的復(fù)發(fā)率，多因素分析顯示CTC為腫瘤復(fù)發(fā)和特異生存的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)[21]。因此，CTC檢測對于評估膀胱癌的預(yù)后有一定意義。

四、展望

目前，CTC的分離和鑒定技術(shù)在不斷完善，特別是聯(lián)合應(yīng)用多種技術(shù)取得了較好的效果，但臨床應(yīng)用仍需要經(jīng)過多中心驗(yàn)證，進(jìn)而標(biāo)準(zhǔn)化；而目前CTC檢測在膀胱癌診治、預(yù)后判斷方面樣本量尚小，也需要后續(xù)的大規(guī)模臨床研究及長期的跟蹤隨訪評估。相信隨著CTC檢測方法的完善、標(biāo)準(zhǔn)化，以及更敏感、更特異的CTC相關(guān)標(biāo)志物的出現(xiàn)，將逐漸建立起CTC標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方案和以其為基礎(chǔ)的膀胱癌診治、療效和預(yù)后評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，形成個(gè)性化治療方案體系。

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(本文編輯：熊鈺芬)

昆明市科技局基金項(xiàng)目(2015-2-S-01577)

650011 昆明市第一人民醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院泌尿外科(嚴(yán)勇、孫洵)；昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科(王劍松)

嚴(yán)勇，E-mail：yyx079@163.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.05.016

2016-10-10)