HPV-16多肽在前列腺癌患者血清抗體篩查中的應(yīng)用

周政 孫玉峰 郭帥 浦金賢 趙曉俊

·實驗研究·

HPV-16多肽在前列腺癌患者血清抗體篩查中的應(yīng)用

周政 孫玉峰 郭帥 浦金賢 趙曉俊

目的探討HPV-16感染與前列腺癌的相關(guān)性及基于HPV-16多肽微陣列芯片在前列腺癌患者血清篩查中的應(yīng)用。方法對來自HPV-16病毒的7個蛋白的胞外段序列進行疊瓦式切割，構(gòu)建基于241條精細多肽庫的微陣列芯片，對經(jīng)病理確診的72例前列腺癌患者和87例前列腺增生患者行血清學(xué)篩查。用微陣列芯片表達差異顯著分析法篩選在前列腺癌患者和前列腺增生患者血清中具有差異性表達的多肽(特異性多肽)；以受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve, ROC)評價這些多肽對前列腺癌的診斷價值，并與PSA相比較。結(jié)果HPV-16多肽在兩組血清中的抗體響應(yīng)不同，與HPV-16多肽反應(yīng)的自身抗體既存在于前列腺癌患者中，也存在于前列腺增生患者中。其中存在15條多肽，與之響應(yīng)的抗體在兩組血清中呈差異性表達；對這15條具有潛在診斷價值的多肽進行ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)多指標聯(lián)合的診斷模型具有更高的診斷效率，由15條多肽構(gòu)成的多指標聯(lián)合診斷模型ROC曲線下面積為0.772，在最佳臨界值的診斷靈敏度為75.3%，特異度為61.8%；PSA的ROC曲線下面積為0.770，在最佳臨界值的診斷靈敏度為65.3%，特異度83.9%。結(jié)論前列腺癌患者血清中存在HPV-16特異性自身抗體，并可通過HPV-16多肽微陣列技術(shù)加以檢測。

前列腺癌； HPV-16； 多肽微陣列

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。關(guān)于前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制目前尚未完全明了。在過去的幾十年間，有大批的實驗報道稱前列腺癌與性活動有關(guān)，是性傳播感染導(dǎo)致的疾病[1-3]。更有大量流行病學(xué)研究表明，多種病毒在前列腺癌進展中具有致癌潛力，例如人乳頭瘤病毒(HPV)、多瘤病毒(SV40)和皰疹病毒家族的成員[4]。其中HPV-16是最常見的高危HPV類型之一，有研究表明以基因檢測法和血清學(xué)篩查法證實HPV-16感染存在于前列腺癌患者之中[3，5]。然而HPV感染與前列腺癌的關(guān)系仍處于研究之中。

過去幾十年中，微陣列的技術(shù)發(fā)展迅速，已成為大規(guī)模和高通量生物學(xué)研究的關(guān)鍵工具，開創(chuàng)了信息收集和分析的新時代。本研究使用一種新型的固體支撐材料—改性聚二甲基硅氧烷(integrated polydimethylsiloxane，iPDMS)，它能夠有效地固定多肽并保持其生物活性，從而滿足體外診斷的要求[6]?；谝陨媳尘?，本實驗擬采用基于iPDMS的多肽微陣列技術(shù)進行研究，并配合生物信息學(xué)手段進行分析，旨在發(fā)現(xiàn)前列腺癌和前列腺增生患者血清中HPV-16相關(guān)抗體表達水平的差異，并進一步評估該方法對前列腺癌的診斷價值。

材料與方法

一、研究對象

本實驗選取2014年9月至2016年1月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的159例經(jīng)B超引導(dǎo)前列腺穿刺活檢的患者，其中病理確診為前列腺癌患者72例，中位年齡71歲(66.7～72.7歲)；病理確診為前列腺增生患者87例，中位年齡64歲(58.0～70.0歲)，患者臨床資料見表1?；颊哐寰勺源┐糖?天清晨空腹靜脈血，室溫下靜置1 h后3 000 r/min 離心10 min，將血清分裝后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。患者均知情同意?/p>

表1 前列腺癌和前列腺增生患者的臨床病理特征

二、多肽的合成及多肽芯片的制備

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的HPV-16的7個功能蛋白(E1、E2、E4、E6、E7、L1和L2)及對應(yīng)氨基酸序列信息，并對其進行疊瓦式切割，每條多肽含20個氨基酸(amino acid, aa)，相鄰的兩條多肽位移10aa，由此，共獲得241條多肽，以HPV-001至HPV-241命名。將iPDMS置于活化液中使表面的羧基基團充分活化，便于與多肽的氨基端或是氨基酸側(cè)鏈的氨基基團結(jié)合形成肽鍵而將多肽固定于iPDMS表面。使用晶芯SmartArrayer 48微陣列芯片點樣儀進行點樣，點樣陣列設(shè)計為9×9×6形式，每一張芯片都由4個子陣列組成，子陣列的四角為人源IgG(陽性對照點)，四邊為PB點(陰性對照點)，中央?yún)^(qū)為多肽區(qū)，點樣完成后靜置過夜固定。使用電視顯微鏡檢驗制備好的芯片，確認沒有缺點和樣品外滲后進行芯片的裝配。制備好的微陣列芯片于4 ℃、真空條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

三、基于HPV-16多肽微陣列芯片的血清學(xué)檢測

取2 μl血清加到198 μl血清稀釋液中形成200 μl稀釋血清，混勻后再加入微陣列芯片中，于搖床孵育儀上150 r/min孵育2 h；用洗液清洗多肽微陣列表面3次，再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG抗體，再次于搖床孵育儀上150 r/min孵育1 h；再用洗液清洗多肽微陣列表面3次，并在芯片表面涂上15 μl超敏化學(xué)發(fā)光底物(7.5 μl發(fā)光底物A+7.5 μl發(fā)光底物B)，在ImageQuant LAS 4000 mini化學(xué)成像分析儀中進行成像，曝光時間2 min。

四、數(shù)據(jù)處理

所得圖像使用GenePix Pro 6.0軟件進行處理，在波長635 nm處采集每一個信號點(包括陰陽性對照點和各條多肽)的信號值(signal intensity：即平均化學(xué)發(fā)光強度)以及芯片的背景信號值(background)。將采集的信號值(signal intensity)轉(zhuǎn)化為信噪比(signal to noise ratio，SNR)形式，SNR=(signal intensity-background)/background。根據(jù)Hecker等[7]的方法，將某一點的信號值高于PB點的平均SNR值+3SD定義為截斷值，則SNR>截斷值為陽性血清學(xué)反應(yīng)。為構(gòu)建基于SNR=截斷值的抗體響應(yīng)譜，定義某一條多肽的響應(yīng)覆蓋率為該條多肽對某一類血清的陽性響應(yīng)血清數(shù)與血清總數(shù)的比值。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)分析和統(tǒng)計圖繪制使用R-Studio V3.0.2軟件進行。采用微陣列芯片表達差異顯著分析法(significance analysis of microarrays, SAM)分析計算前列腺癌患者和前列腺增生患者血清中具有差異性表達的多肽(優(yōu)勢多肽)，以q值<0.05為差異多肽入選標準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；使用受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve, ROC)評估差異性表達自身抗體的診斷價值。

結(jié) 果

一、兩組血清抗體篩選結(jié)果

血清學(xué)檢測結(jié)果表明，iPDMS可以很好地將背景噪音控制在合理范圍內(nèi)。本實驗中PB點的平均SNR值約為0.5±0.3，截斷值約為1.4，這里取2，則SNR>2為陽性血清學(xué)反應(yīng)。結(jié)果顯示兩組血清中均存在自身抗體響應(yīng)情況，與HPV-16多肽反應(yīng)的自身抗體既存在于前列腺癌患者中，也存在于前列腺增生患者中。進一步通過SAM計算對比兩組血清中抗體響應(yīng)的差異，發(fā)現(xiàn)存在15條多肽，與之響應(yīng)的抗體在前列腺癌中高表達，與前列腺增生組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

二、特異表達自身抗體診斷價值的評估

為評估前列腺癌患者血清中高表達自身抗體的診斷價值，分別對此15條差異性表達的多肽自身抗體作ROC曲線分析，對比每條多肽的曲線下面積，發(fā)現(xiàn)單指標難以達到十分理想的診斷效果(表2)。通過多次比較分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合此15條多肽構(gòu)成的診斷模型能有效提高診斷效率，由此得到的ROC曲線下面積為0.772(95%置信區(qū)間0.700～0.843)(圖2)，此時最佳臨界值為3，在最佳臨界值的診斷靈敏度為75.3%、特異度為61.8%。PSA的ROC曲線下面積為0.770(95%置信區(qū)間0.692～0.848)，診斷靈敏度為65.3%、特異度為83.9%。多肽聯(lián)合診斷模型對前列腺癌有較高的診斷價值。

表2 單指標與多指標聯(lián)合診斷模型在最佳臨界值的診斷靈敏度和特異度及ROC曲線下面積

圖1 差異表達的HPV-16自身抗體篩選(右上角紅色圓圈代表在該15條多肽的自身抗體在前列腺癌患者中高表達)

討 論

近年來，隨著高通量檢測平臺例如噬菌體展示和蛋白質(zhì)微陣列的快速發(fā)展，腫瘤相關(guān)自身抗體被發(fā)現(xiàn)并用作腫瘤早期的微創(chuàng)診斷工具。然而，血清中的抗體十分復(fù)雜，以致在篩選期間可出現(xiàn)模擬表位或分子模擬[6]。此外，免疫的多樣性也可導(dǎo)致靈敏度與特異度之間的失衡[8]。僅僅依靠一條多肽的響應(yīng)確定是否存在特異性的抗原抗體關(guān)系，其結(jié)果非常不可靠，存在大量的假陽性和假陰性。我們認為：如果一份血清同時對來自一個蛋白質(zhì)的多條多肽有響應(yīng)，其特異性抗原抗體響應(yīng)的可靠性大大提高。但是多數(shù)情況下，一個蛋白質(zhì)的線性表位有限(和蛋白質(zhì)的大小有關(guān)，和免疫原性有關(guān))，因此發(fā)生特異性抗原抗體的反應(yīng)也有限。同理，如果一份血清對來自同一個病毒的多個蛋白質(zhì)的多條多肽有響應(yīng)，則發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)的抗體增加，診斷的可靠性也隨之提高。因此，我們將HPV-16的7種蛋白質(zhì)切割為241條多肽，以形成多肽微陣列芯片用于血清學(xué)篩查。結(jié)合SAM分析，成功地從241條多肽中篩選出在兩組血清中具有差異性表達的15條多肽，聯(lián)合此15條多肽構(gòu)建的診斷模型，使得同一份血清對多條特異性多肽響應(yīng)，大大提高了診斷的可靠性。

圖2 15條多肽聯(lián)合診斷的ROC曲線圖和PSA的ROC曲線圖

早在1990年，即有人通過Southern印跡和PCR等方法在前列腺癌組織細胞中檢測出高危型HPV DNA[9-10]，證實前列腺癌與HPV感染有關(guān)；近年來也有研究重復(fù)了此類方法并得到相同的結(jié)論[5]。本實驗以血清特異性抗原抗體反應(yīng)為機制，用全新的血清學(xué)篩查方法，發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者血清中存在與15條特異性HPV-16多肽反應(yīng)的高表達抗體，且響應(yīng)覆蓋率明顯高于前列腺增生組(P<0.05)，前列腺癌患者或存在HPV感染，并可以此方法區(qū)分前列腺增生患者。本實驗結(jié)果也與許多流行病學(xué)研究結(jié)果類似[11-12]。Chen等[11]和Lin等[12]的研究發(fā)現(xiàn)有高達65%的前列腺癌患者存在HPV感染，并證實有數(shù)個高危型(HPV-16、HPV-18等)與前列腺癌病變的發(fā)生有關(guān)。諸多證據(jù)表明，HPV感染可能與前列腺癌疾病相關(guān)。

我們進一步建立ROC曲線評價血清中高表達抗體對前列腺癌的診斷價值。15條多肽聯(lián)合診斷模型的ROC曲線下面積為0.772，在最佳臨界值的診斷靈敏度為75.3%，特異度為61.8%。其ROC曲線下面積與PSA的0.770相似，而診斷靈敏度高于PSA(65.3%)，表明該模型對前列腺癌有較高的診斷價值。而相對較低的特異度，可能是由于血清中HPV免疫狀態(tài)與實際組織中HPV感染不符，即血清中HPV相關(guān)抗體可能由前列腺解剖部位以外的HPV感染引起，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。此外，既往感染與當(dāng)前疾病狀態(tài)的復(fù)雜聯(lián)系也可能擾亂人類血清中的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

HPV感染與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制尚未明確。大量研究表明HPV感染與許多腫瘤的發(fā)生有關(guān)，特別是宮頸癌[13]，為HPV感染與前列腺癌的關(guān)系提供了假設(shè)依據(jù)；同時，陰莖癌和尿道HPV病變的發(fā)現(xiàn)，也間接表明HPV病毒顆粒或可經(jīng)尿道感染前列腺從而致病[14]；此外，分子學(xué)研究還表明HPV的E6和E7基因，編碼的致癌蛋白可分別與腫瘤抑制蛋白Rb和P53結(jié)合并抑制其活性，最終使前列腺上皮細胞永生化[11]。

綜上所述，前列腺癌患者血清中高度表達的特異性抗原抗體反應(yīng)，表明HPV-16感染可能與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。我們通過對患者血清中特異性抗體的檢測，可初步判斷患者的患癌風(fēng)險。本實驗的一個主要優(yōu)勢是采用基于多肽微陣列芯片的血清學(xué)篩查方法，第一次研究中國人群中前列腺癌患者和前列腺增生患者血清中HPV-16相關(guān)特異性抗體水平的差異，并得到了較好的實驗結(jié)果。然而實驗中的樣本量有限，實驗條件也有待提高，在后續(xù)的研究中還需進一步完善。此外，聯(lián)合血清學(xué)篩查和基因檢測等方法或可以更好地評估前列腺癌與HPV感染的關(guān)系。

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(本文編輯：熊鈺芬)

Application of HPV-16 peptides based microarray technology in the seroscreening of prostate cancer

ZHOUZheng,SUNYu-feng,GUOShuai,PUJin-xian,ZHAOXiao-jun.

DepartmentofUrology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,ChinaCorrespondingauthor:ZHAOXiao-jun,E-mail:xiaojunzhao116@163.com

Objective To investigate the relationship between HPV-16 infection and prostate cancer by using the HPV-16 peptides based microarray in the seroscreening. Methods Antigen sequences from seven proteins of HPV-16 were cut into 20 mer peptides containing overlaps of 10 amino acids, resulting in a total of 241 HPV-16 peptide microarrays. 159 serum samples (72 prostate cancer subjects and 87 BPH samples) were included in the serological search. Significant analysis of microarray was used to identify peptides that performed differential expression between the two groups. Receiver operating characteristic (ROC) analyses were performed to assess the predictive value of the identified peptides when compared with PSA, and a p value < 0.05 was considered statistically significant. Results HPV-16 related antibodies existing in both prostate cancers and BPH patients, specific antibodies-epitope interactions performed different in the two groups. 15 peptides were identified as statistically significantly higher responding peptides in prostate cancer samples. ROC analyses showed that the diagnosis model with multi-index combination had higher diagnostic efficiency. The area under the ROC curve was 0.772, with sensitivity of 75.3% while a specificity of 61.8% when set the cutoff value to 3. Area under the ROC curve of PSA was 0.770, with sensitivity of 65.3% while a specificity of 83.9%. Conclusions Results showed HPV-16 related specific antibodies exists in prostate cancer and could be detected by HPV-16 based microarray.

Prostate cancer; HPV-16; Peptide microarray

215006蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科

趙曉俊，E-mail:xiaojunzhao116@163.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.05.010

2016-09-20)