基于雙指標分析法和聚類分析法的白刺紅外指紋圖譜比較研究

趙 薇,陳奕君,孟慶艷,乜 廣,張 玲,*,李 瑩,劉 圓

(1.西南民族大學藥學院，四川成都 610041;2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029;3.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室,新疆阿拉爾 843300;4.西南民族大學民族醫(yī)藥研究院,四川成都 610041)

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基于雙指標分析法和聚類分析法的白刺紅外指紋圖譜比較研究

趙 薇1,陳奕君2,孟慶艷3,乜 廣3,張 玲3,*,李 瑩1,劉 圓4,*

(1.西南民族大學藥學院，四川成都 610041;2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029;3.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室,新疆阿拉爾 843300;4.西南民族大學民族醫(yī)藥研究院,四川成都 610041)

采用雙指標序列分析法和聚類分析法對7種不同白刺屬植物的紅外指紋圖譜進行比較分析,利用共有峰率和變異峰率2個指標,以不同來源樣品的紅外指紋圖譜為標準,計算出所測樣品間的共有峰率和變異峰率,并按照共有峰率的大小建立不同的雙指標序列分析法,研究各產地白刺的異同。結果表明:不同來源的植物樣品中G3與G6的成分最為相似,相似度為57.89;G3與G5次之,相似度為52.63;G1、G7與其他各樣品的相似程度最低。紅外光譜指紋圖譜結合聚類分析或雙指標序列法,可以快速、無損地鑒別不同產地的白刺,為區(qū)別不同產地不同品種白刺提供一種切實可靠的方法。

白刺,紅外指紋圖譜,共有峰率,變異峰率,雙指標序列法,聚類分析

表1 樣品來源
Table 1 Sample source

樣品名稱來源采集時間G1小果白刺NitrariasibiricaPall新疆克州阿合奇縣2010年4月G2泡泡刺NitrariasphaerocarpaMaxim新疆巴州和碩縣2010年3月G3泡泡刺NitrariasphaerocarpaMaxim新疆阿克蘇柯坪縣2010年4月G4帕米爾白刺NitrariapamiricaVassil新疆喀什塔縣至阿克圖途中2010年4月G5泡泡刺NitrariasphaerocarpaMaxim新疆巴州和碩縣2010年4月G6大白刺NitrariaroborowskiiKom新疆阿克蘇新和縣2010年4月G7白刺NitrariatangutorumBobr新疆巴州和靜縣拉音克草原2010年4月

白刺屬(NitrariaL)為蒺藜科的一個古老小屬,自然分布在干燥、鹽堿、多風、植被稀少的嚴酷環(huán)境中,其有很強的抗逆性,是典型的旱生或超旱生荒漠植物[1]。目前全世界已發(fā)現13種,我國分布有8種,資源十分豐富,主要分布西北地區(qū)及內蒙古等地[2]。白刺果味甜帶酸,有“沙漠櫻桃”的美稱[3],具有很高的營養(yǎng)價值,富含氨基酸、維生素、黃酮、皂苷、生物堿、礦物質等營養(yǎng)元素和活性成分[4],民間用于治療脾胃虛弱、消化不良、神經衰弱、乳汁不下等癥狀,其葉亦作為民間藥用于治療痙攣、心律不齊及神經痛等癥[5]。目前關于白刺的報道,主要集中在環(huán)境保護及生理特性研究,對其化學成分分析報道較少。紅外指紋圖譜能夠反映中藥材各種化學成分的整體信息,其操作簡單,測試速度快成本低,便于兩個及以上樣品之間的比較,所得結果專屬性強,準確性高,應用范圍廣等優(yōu)點,目前已成為中藥材、食品、水果等產地鑒別的重要手段[6-7]。

近年來,紅外指紋圖譜的共有峰率和變異峰率的雙指標分析法作為一種新的算法,可以在2+n維空間中考察不同樣品之間的相互關系,并能比較精確地知道任意一個樣品與其他樣品的遠近關系,且對實驗樣沒有嚴格的要求。系統(tǒng)聚類分析法,在生物學領域也被廣泛應用,但目前還未見用上述方法研究白刺的報道。本實驗采用FTIR技術,以共有峰率及變異峰率雙指標序列法和系統(tǒng)聚類分析法分析七種白刺屬植物樣品紅外指紋特征,并進行歸類比較,旨在為白刺屬植物質量評價提供簡單可靠的分析方法[8-9]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白刺全株 共7批,分別來源于6個不同產地,均經塔里木大學孟慶艷副研究員分別鑒定為白刺屬植物:小果白刺NitrariasibiricaPall.、泡泡刺NitrariasphaerocarpaMaxim.、帕米爾白刺NitrariapamiricaVassil.、大白刺NitrariaroborowskiiKom.、白刺NitrariatangutorumBobr.,樣品來源見表1。

Nicolet380(K)傅立葉紅外光譜儀(掃描范圍為400～400 cm-1,分辨率選擇為4 cm-1) 賽默飛世爾科技公司;YP-2 壓片機 上海山岳科學儀器公司;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;KBr光譜純 天津市光復精細化工研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 測試樣品制備 取原藥材,于60 ℃烘箱中干燥48 h,粉碎,過200目篩,稱取藥材粉末若干分別與干燥后的溴化鉀粉末樣品,按1∶10比例混合,于紅外燈照射條件下在瑪瑙乳缽中研磨均勻,裝入壓片模具,在抽真空狀態(tài)下用油壓機以 27 MPa 壓力壓制 2 min,然后用鑷子小心取下壓片(厚度約 1 mm),裝入樣品架進行分析測試。不同樣品分開研磨,壓片器每次使用均需處理干凈。

1.2.2 紅外光譜測定 以KBr為背景累積掃描32次,每個樣品平行測3次,取其平均光譜圖,所有光譜圖均扣除KBr背景光譜。原始光譜數據首先經OMNIC軟件編寫的程序進行多點基線校正,除去基線影響,接著采用移動平均平滑,然后將預處理后的光譜數據導入軟件Unscrambler 9.1進行標準歸一化(standard normalvariate,SNV),去除不同樣本稱量的差異。

1.2.3 紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標的建立 本實驗主要以不同產地的7個白刺屬植物為實驗材料,識別其紅外指紋圖譜吸收峰,建立其紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法[10-11]。即:

P(共有峰率)=Ng(共有峰數)/Nd(兩個IR圖中的獨立峰數)×100%

N(共有峰數):指在比較的兩個IR圖中都出現的吸收峰的個數

n(獨立峰):紅外指紋圖譜中不同的吸收峰

na:指紋圖譜a中相對與其共有峰的非共有峰數,稱為a 的變異峰數

nb:指紋圖譜b中相對與其共有峰的非共有峰數,稱為b 的變異峰數

Nd:獨立峰數,相互比較的兩個IR圖中的獨立峰總數Nd=Ng+na+nb

Pv:變異峰率(變異鑒別指標,一個指紋圖譜的變異峰率)

P:該IR圖中相對于共有峰的變異峰數與其共有峰數的比值

Pva:指紋圖譜a 的變異峰率 Pva=(na÷Ng)×100%

Pvb:指紋圖譜b 的變異峰率 Pvb=(nb÷Ng)×100%

Na:指紋圖譜a的總峰數 Na=Ng+na

Nb:指紋圖譜b的總峰數 Nb=Ng+nb

1.2.4 重復性實驗 在相同條件下,平行測定6份同一個來源的樣品,結果表明,紅外指紋圖譜具有良好的重復性,共有峰率大于80.0%。

1.3 數據處理方法

1.3.1 雙指標序列法 以不同樣品為參考,以指紋圖譜共有峰率和變異峰率計算公式,分別計算其他樣品紅外指紋圖譜的共有峰率和變異峰率,并且根據共有峰率的大小排成一個序列(包含共有峰率和變異峰率值),該序列稱為共有峰率和變異峰率雙指標序列,n個樣品可得n個不同的序列,故可構成2+n維序列空間[12]。

1.3.2 聚類分析 從圖1中可知 1750～850 cm-1波段范圍內吸收峰的位置和吸收強度差異較為明顯,具有一定的特征性和指紋性,提取該波段的透過率值作為聚類分析的原始數據。取不同產地樣本的平均圖譜,基于歐式距離,運用SPSS 19.0對白刺和泡泡刺的紅外光譜進行分析,以不同波數段上的吸光度為指標,7個樣品之間歐氏距離系數在0～25之間。

2 結果與分析

2.1 白刺的紅外指紋圖譜及數據

將7批白刺樣品按照“1.2.1”及“1.2.2”下實驗方法進行遠紅外光譜測定,其樣品無損檢測疊加紅外指紋圖譜見圖1。其中3389.7 cm-1是由蛋白質 N-H 伸縮振動、糖分子中O-H伸縮振動以及不飽和脂肪酸中=C-H 伸縮振動引起,該峰是明顯的寬而強的吸收峰;2920.5 cm-1及2853.2 cm-1處小肩峰分別代表亞甲基的順式伸縮振動與反式伸縮振動,吸收強度中等;1745.4 cm-1是由酯C=O伸縮振動引起,吸收強度較弱;1653.5 cm-1為酰胺Ι鍵特征吸收[13-14](蛋白質酰胺鍵 C=O 伸縮振動以及N-H面內彎曲振動頻率與部分 C-N 伸縮振動頻率偶合產生的吸收峰)及不飽和脂肪酸 C=C 伸縮振動引起,是很強的吸收峰;結果分析表明:雖然不同產地的白刺樣品的紅外光譜基本一致,但在吸收峰的數目、形狀和強度等方面仍存在一定差異。而圖譜直接比對得到的信息有限且不利于分析結果的量化顯示,需結合其他方法獲取更多的信息。

圖1 樣品的紅外光譜疊加圖Fig.1 The overlapping IR fingerprint spectra of sample注:圖中最左側波數為4000 cm-1時,從上至下依次是樣品G1～G7。

共有峰的確定方法:對于一組吸收峰,若組內的吸收峰的波數最大差異顯著小于其與相鄰組之間的平均波數差,并且每個樣品都存在該組峰的波數,可確定該組峰是一組共有峰。在表2中,多數組峰很明顯滿足這種確定方法,它們可以明確判定為共有峰。例如551.23 cm-1對應的組峰與鄰近的組峰較為接近,551.23 cm-1對應組峰的平均波數為548.91 cm-1,組內最大波數差為5.31 cm-1,該組的平均波數與前后臨近的兩組峰的平均波數差分別為12.14 cm-1和13.0 cm-1,兩個值明顯大于5.31 cm-1,故可確認551.23 cm-1對應的一組峰是共有峰[15],表2中屬于同一列的吸收峰為共有峰。

表2 白刺紅外指紋圖譜波數及共有峰識別結果
Table 2 The wavenumber and common peaks of FTIR spectra ofNitrariaL

樣品紅外指紋圖譜吸收峰波數(cm-1)G1336840292196284963173350163409140777-G2335255292655--165157141147-G3333730292931--164576-138500G4336363292592--164525140372-G5336363292718--164567-138431G6335778292978--163987141941-G7335772291993--163580-138448G1132007124974107913---60531G2131662126109106287--62866-G3132036-10616866843660136152560530G4131713124560107200--6217859615G5132109123708106501--61822-G6131447-107033-661046164460241G7--106559--61911-G157453-5512353434-5155749477G25763455861-5332652975--G3-56160---5189449889G4---541675244851226-G5---5379752838-49477G657571-5495853677-5184149179G757453562965459253148---G1475664613845653-G2--4572043373G347632--43875G4---43578G54761746032-43874G648007463004531243858G748117463804492644000

表3 紅外圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析結果
Table 3 Dual-index sequential analysis of common and variant peak ratioin infrared fingerprint ofNitrariaL

樣品共有峰率和變異峰率G1G1∶G6(7143；20，20)G4(5263；80，10)G2(455；80，40)G5(4545；80，40)G7(4286；8889，4444)G3(375；100，6667)G2G2∶G4(6875；272，6364)G3(6154；75，875)G7(5556；40，40)G5(5294；4444，4444)G6(5238；2727，6364)G1(4545；80，40)G3G3∶G2(6154；75，875)G6(5789；2727，4545)G5(5263；50，40)G4(4737；6667，4444)G7(45；6667，5556)G1(375；100，6667)G4G4∶G2(6875；2727，1818)G5(5882；30，40)G6(55；1818，6364)G1(5263；80，10)G3(4737；6667，4444)G7(35；8571，100)G5G5∶G4(5882；30，40)G7(5556；40，40)G2(5294；4444，4444)G3(5263；50，40)G6(5238；2727，6364)G1(4545；80，40)G6G6∶G1(7143；20，20)G7(60；50，166)G3(5789；2727，4545)G4(55；1818，6364)G5(5238；2727，6364)G2(5238；2727，6364)G7G7∶G6(60；50，1667)G2(5556；40，40)G5(5556；40，40)G3(45；6667，5556)G1(4286；8889，4444)G4(35；8571，100)

2.2 雙指標序列法結果分析

本實驗以7個樣本為參照點,建立共有峰率和變異峰率雙指標序列,形成多維序列空間利用該多維雙指標序列空間可以方便地找到某一樣品的最相近樣品,從而可以避免在單一序列空間中比較不同樣品。表3中,G1:G4(52.63;80,10)表示該序列以G1為標準計算其他樣品指紋圖譜的共有峰率和變異峰率,該序列片段表示G1與G4的共有峰率為52.63,相對于共有峰率的變異峰率分別為G1為80,G4為10。

2.3 基本關系組、對及分析

A組:G7∶G2(55.56;40,40) G7∶G5(55.56;40,40) G6∶G5(52.38;27.27,63.64) G6∶G2(52.38;27.27,27.27)

B組:G2∶G5(52.94;44.44,44.44) G2∶G6(52.38;27.27,63.6 4) G5∶G3(52.63;50,40) G5∶G6(52.38;27.27,63.64)

C組:G5∶G4(58.82;30,40) G5∶G7(55.56;40,40) G3-G4(47.37;66.67,44.44) G3-G7(45;66.67,55.56) G1∶G5(45.45;80,40) G1∶G7(42.86;88.89,44.44)

A組中G2與G5相對于G7和G6有相同的共有峰率和變異峰率,分別為(55.56;40,40)和(52.38;27.27,63.64),由此可見二者的成分最為接近。

B組中G2、G3、G6相對于G5有相近的共有峰率,變異峰率相差也較小;G6、G5相對于G2的共有峰率很接近,變異峰率相差也較小;由此可見G2、G3、G6、G5的成分很接近。

C組中G4、G7相對于G5和G3,G5、G7相對于G1有較為接近的共有峰率和變異峰;由此可見G4與G7、G5與G7的成分較為接近。G1與其他樣品的差異最大,G7與其他樣品的差異也較大。

2.4 各樣品光譜特征聚類分析

通過圖2可知,各測試樣品可分為3個表征群,G2與G4首先聚在一起,然后G3與G6、G5、G7聚在一起,G1自己歸為一類。

圖2 白刺屬樣品聚類分析樹狀圖Fig.2 Hierachical clustering analysis of the Nitraria L sample

3 結論

3.1 雙指標序列分析法結果

通過雙指標序列分析法分組,得到A組、B組、C組,可以看出G2與G5化學成分最為相近;其次是G2與G3、G5與G6較為接近,差異較大的是G4、G5、G7;G1與其他樣品的差異均很大?？傮w看來,G2與G5為同一地區(qū)同種植物,成分最為接近,而且采集地相近的樣品則較為相似,由此可見雙指標序列分析法可以準確的將各樣品完全分開,細致的描述各樣品之間差異的大小。

3.2 聚類分析法結果

聚類分析將樣品分為三組:G2與G4一組;G3、G6、G5、G7一組;G1與其他樣品的差異較大;由此可見聚類分析可以大體上將樣品區(qū)分開,同時能夠較為準確的描述各樣品之間的差異。

3.3 結果對比分析

從兩種分析方法可以看出,雙指標序列分析法及聚類分析法均可以分析白刺指紋圖譜數據。在實際應用過程中,上述兩種方法均有特點,雙指標序列法能夠精確辨認出關系最近的樣品,但共有峰率及變異峰率的計算較繁瑣;聚類分析相對簡便,但其精確度低于雙指標分析法,只適合一般歸類,因此在樣品量不大時,兩種方法均可應用于藥材質量評價,樣品量較大時,應用聚類分析法相對簡便。兩種分析方法結果總體上沒有表現出較好的統(tǒng)一性,可能是由于應用系統(tǒng)聚類分析法時,只做了初始數據聚類分析。

[1]新疆植物志編輯委員會. 新疆植物志[M]. 第四卷. 烏魯木齊:新疆科學技術出版社,2005:326～329.

[2]江繼武. 藥用植物辭典[M]. 天津:天津科學技術出版社,2005:543.

[3]張玲,王旭哲,李先勇,等. 不同保存條件下白刺屬植物基因組DNA的提取[J]. 鄭州大學學報(理學版),2013,45(2):99-103.

[4]薛焱,王同智,薛永志,等. 內蒙古地區(qū)白刺屬植物主要活性成分含量比較研究[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(5):106-108.

[5]馮云子,馮淑環(huán),殷麗君,等. 白刺主要功能性成分及其功效研究進展[J]. 食品工業(yè)科技,2010,31(7):371-375.

[6]李瑩,孫卓然,袁瑋,等. 不同種石斛的相似性的共有峰和變異峰雙指標序列分析[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(10):2455～2457.

[7]舒尊哲,姜秀娟,孟慶艷,等. 大白刺不同部位中總黃酮的含量測定[J]. 安徽農業(yè)科學,2010,38(6):2947-2948.

[8]蔡皓,秦昆明,劉曉,等. 用共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法分析百合的紅外指紋圖譜[J]. 紅外,2010,31(11):38-43.

[9]孔德鑫,黃庶識,黃榮韶,等. 基于雙指標分析法和聚類分析法的雞骨草紅外指紋圖譜比較研究[J]. 光譜學與光譜分析,2010,30(1):45-49.

[10]陳勇,魏后超,韋韜,等. 磨盤草藥材紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2015,30(3):709-712.

[11]陳蓉,陳廣云,沈蓓,等. 基于共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法的芡實紅外指紋圖譜研究[J]. 中國藥房,2012,23(23):2141-2146.

[12]程云清,劉劍鋒,劉強,等. 高山紅景天紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率的雙指標序列分析[J]. 南京農業(yè)大學學報,2011,34(5):155-158.

[13]黃麗萍,吳靜. 自然銅遠紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法[J]. 中國中藥雜志,2011,36(11):1441-1444.

[14]王燕,王斌,徐銀峰,等. 基于聚類分析法和雙指標分析法的淡菜紅外指紋圖譜比較研究[J]. 中國食品學報,2013,13(1):178-182.

[15]黃錦茶,陳豐連,徐鴻華,等. 崗梅根紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2011,22(2):369-371.

[16]王斌,任西杰,王燕,等. 基于聚類、主成分和判別分析的海馬醇提物紅外指紋圖譜研究[J]. 中國藥學雜志,2013,48(4):253-258.

Comparative study on the infrared fingerprint of nitraria tangutorum bobr. based on the methods of sequential analysis of dual-indexes and cluster analysis

ZHAO Wei1,CHEN Yi-jun2,MENG Qing-yan3,NIE Guang3,ZHANG Ling3,*,LI Ying1,LIU Yuan4,*

(1.College of medicine,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China; 2.School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 3.Biological Rsource Protection and Utilization Keystone Lab of Tarim Basin,Alaer 843300,China; 4.Ethnic medicine institute,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

The method of sequential analysis of dual-indexes and cluster analysis were utilized to investigate the infrared fingerprints of 7 plant species of the genusNitrariaL.Using common peak ratio index and variant peak ratio index,based on IR fingerprint ofNitrariaL. from different regions,common peak ratio and variant peak ratio of 7 samples were calculated respectively to set up a new method called dual-index sequence analysis for distinguishing samples from different regions. The result showed that the compositions of G3 and G6 were the most similar,and the similarity was 57.89,in different plant samples. The similarity between G3 and G5 was 52.63,the similarity among G1,G7 and other samples were the lowest.On the whole,FTIR combined with cluster analysis or sequential analysis of dual-indexes provided an effective way to identify the regions ofNitrariatangutorumBobr. rapidly and simply,For the difference between different regions of different varieties of white provided a practical and reliable method.

NitrariaL;IR fingerprint;common peak rate;variation peak rate;double index sequence method;clustering analysis

2016-05-12

趙薇(1992-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：民族藥品種、質量和新藥資源保護與利用，E-mail:18215652992@163.com。

*通訊作者:張玲(1977-)，女，碩士，副教授，主要從事植物分子生物學研究，E-mail:zhlzky010@163.com。 劉圓(1968-)，女，博士，教授，主要從事民族藥物的教學和科研工作，E-mail:499769896@qq.com 。

“十三五”國家科技支撐計劃(2015BAC05B02)；四川省科技支撐計劃(2014SZ0159)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項基金項目(2015NZYQM46)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)23-0286-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.045