酶解香菇柄蛋白制備抗氧化肽的工藝研究

張 璐,曹 暉,*,弓志青,張 婷,于漫漫,葛林麗,王文亮

(1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225000;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所,山東濟(jì)南 250100)

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酶解香菇柄蛋白制備抗氧化肽的工藝研究

張 璐1,曹 暉1,*,弓志青2,張 婷1,于漫漫1,葛林麗1,王文亮2

(1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225000;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所,山東濟(jì)南 250100)

以香菇柄蛋白為原料,對其進(jìn)行酶解以制備具有抗氧化活性的多肽,為香菇柄的精深加工提供理論基礎(chǔ)。首先進(jìn)行蛋白酶的篩選,在最佳蛋白酶為堿性蛋白酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行酶解單因素實(shí)驗,再運(yùn)用四因素三水平的響應(yīng)面分析法研究底物濃度、加酶量、pH、溫度對提取工藝的影響,以DPPH自由基清除能力為響應(yīng)值,確定酶解的最優(yōu)條件為:底物濃度2%,加酶量4700 U/g,pH為8.3,酶解溫度為55 ℃,酶解時間為2.5 h,此條件下的DPPH自由基清除率達(dá)到63.2%,即香菇柄多肽具有一定的抗氧化活性,可以為開發(fā)香菇柄產(chǎn)品提供依據(jù)。

香菇柄,蛋白,酶解,自由基清除率,抗氧化肽

香菇(Lentinusedodes)是側(cè)耳科(Plearataco)擔(dān)子菌的一種藥食兩用的真菌,含有多種營養(yǎng)成分如多糖、纖維素、氨基酸、香菇菌素、香菇香精及礦物質(zhì)元素鐵、鈣、磷等[1]。香菇柄是香菇產(chǎn)品加工過程中的副產(chǎn)品,約占香菇干重的15%～30%,由于菇柄含粗纖維較多,口感較差,絕大部分都被廢棄,少量用作飼料,全國每年廢棄的香菇柄有數(shù)萬噸,造成了資源的極大浪費(fèi)[2]。實(shí)際上香菇柄中也含有多種的營養(yǎng)成分,目前人們對香菇柄的研究多集中在多糖和膳食纖維的功效作用上[3-5],已開發(fā)出的香菇柄產(chǎn)品包括低糖香菇柄脯、香菇柄膳食纖維飲料、香菇柄仿真肉味素食品、香菇柄松[6-9]等。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香菇柄蛋白粉 實(shí)驗室自制(蛋白含量為62.7%);1,1-二苯基-2-苦基肼 北京中生瑞泰科技有限公司;中性蛋白酶(pH7,溫度45 ℃,酶活100 U/mg)、堿性蛋白酶(pH8,溫度45 ℃,酶活200 U/mg)、木瓜蛋白酶(pH6.5,溫度65 ℃,酶活800 U/mg)、復(fù)合蛋白酶(pH6.5,溫度45 ℃,酶活120 U/mg)及胰蛋白酶(pH7.8,溫度55 ℃,酶活250 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液 上海麥克林生化科技有限公司;氫氧化鈉、甲醛、鹽酸、無水乙醇等 均為國產(chǎn)分析純。

CR22D Ⅲ型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;78HW-1型恒溫磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精密實(shí)驗設(shè)備有限公司;便攜式PH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-6100型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;AR423CN型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 香菇柄蛋白的酶解工藝 配制一定濃度的香菇柄蛋白溶液,在所用酶最適pH和溫度的條件下,加入一定量的蛋白酶,加熱震蕩水解,然后在95 ℃水浴中維持15 min滅酶,最后6000 r/min離心取上清液,所得上清液即為香菇柄蛋白酶解液。

1.2.2 蛋白酶的篩選 本實(shí)驗選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶,在濃度3%,加酶量5000 U/g,酶解時間2 h的條件下,五種酶在各自最適溫度和pH下酶解,以水解度和DPPH·清除率為指標(biāo),確定酶解香菇柄蛋白的最佳蛋白酶。

1.2.3 單因素實(shí)驗 在最佳蛋白酶的基礎(chǔ)上,酶解條件為:在加酶量5000 U/g、溫度50 ℃、pH8.0、酶解時間2 h的條件下,研究不同底物濃度(1%、2%、3%、4%、5%)對水解度和DPPH·清除率的影響;在底物濃度3%、溫度50 ℃、pH8.0、酶解時間2 h的條件下,研究不同加酶量(3000、4000、5000、6000、7000 U/g)對水解度和DPPH·清除率的影響;在底物濃度3%、加酶量5000 U/g、pH8.0、酶解時間2 h的條件下,研究不同溫度(40、45、50、55、60 ℃)對水解度和DPPH·清除率的影響;在底物濃度3%、加酶量5000 U/g、溫度50 ℃、酶解時間2 h的條件下,研究不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)對水解度和DPPH·清除率的影響;在底物濃度3%、加酶量5000 U/g、溫度50 ℃、pH8.0的條件下,研究不同時間(2,2.5,3,3.5,4 h)對水解度和DPPH·清除率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗 在單因素的基礎(chǔ)上,以DPPH·清除率為響應(yīng)值,選取四個對響應(yīng)值影響較大的因素進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗。四個因素分別為底物濃度、加酶量、酶解溫度、pH,根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗設(shè)計的方案,各因素的編碼及水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面自變量因素編碼及水平
Table 1 Independent variables and their levels used in response surface

因素水平-101A底物濃度(%)102030B加酶量(U/g)400050006000C酶解溫度(℃)505560DpH808590

1.2.5 DPPH·自由基清除率的測定 稱取0.0014 g DPPH,避光處,無水乙醇溶解并定容至100 mL。取3 mL DPPH溶液在515 nm處測定吸光值A(chǔ)c。再取0.2 mL酶解液,加入2.8 mL DPPH溶液,避光放置30 min后測吸光值A(chǔ)s,每隔幾分鐘記錄一次吸光值,直到吸光值保持穩(wěn)定,每分鐘內(nèi)部超過0.003單位即可[12]。計算公式如下:

DPPH·自由基清除率(%)=(Ac-As)/Ac×100

1.2.6 水解度的測定 參考周慧江[13]等的測定方法,取5 mL酶解液,加入25 mL蒸餾水,用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)pH至8.2,然后加入10 mL中性甲醛溶液,再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)pH至9.2,記錄加入甲醛后NaOH的消耗量,另用30 mL蒸餾水作空白對照。計算公式如下:

X=(V1-V2)×C×0.014/V3

DH(%)=樣品中氨基態(tài)氮的含量/樣品總氮量×100

式中:X=樣品中氨基氮的含量(g/100 mL);V1=加入甲醛溶液后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);V2=空白組加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);V3=樣品取用量(mL);C=NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L);14=氮的摩爾質(zhì)量(g/mol);總氮量由凱氏定氮法測得。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 利用Design-Expert8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解用酶的篩選

由于每種蛋白酶都有自己特定的酶切點(diǎn),因此酶解得到的多肽活性也不相同,并且每種蛋白酶的酶解效果不一樣,對應(yīng)的水解度也就不同[14]。如圖1所示,五種蛋白酶對香菇柄蛋白的酶解效果存在差異,相比之下,堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解香菇柄蛋白的DH較高,而中性蛋白酶和堿性蛋白酶水解得到的多肽溶液DPPH·自由基清除率較高。雖然復(fù)合蛋白酶的水解效果最好,但考慮到要制備活性更高的多肽,因此綜合比較下,本實(shí)驗選擇堿性蛋白酶進(jìn)行水解。

圖1 五種蛋白酶的酶解效果比較Fig.1 Comparison of enzymatic hydrolysis effects of five kinds of proteases

2.2 單因素實(shí)驗結(jié)果

2.2.1 底物濃度對水解度和DPPH·清除率的影響 如圖2所示,水解度隨底物濃度的增加呈降低的趨勢,可能是由于底物濃度越大,酶與底物的結(jié)合力越低,酶解不充分,導(dǎo)致水解度越來越小,底物濃度為1%時水解度最大。DPPH·自由基清除率隨底物濃度的增加先增大后減小,在底物濃度為3%時達(dá)到最高,綜合考慮選擇底物濃度1%～3%為最佳范圍。

圖2 底物濃度對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.2 Effect of concentration of substrate on DH and DPPH radical scavenging capacity

2.2.2 加酶量對水解度和DPPH·清除率的影響 如圖3所示,隨著加酶量的增加,水解度先增大后保持穩(wěn)定。當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r,不斷增加酶量,而底物的量是有限的,因此水解度在達(dá)到最高值后會保持不變。在加酶量為5000 U/g時,DPPH·自由基清除率達(dá)到最大值為36.1%,隨后呈現(xiàn)下降的趨勢。這可能是由于隨著加酶量的增大,蛋白質(zhì)逐漸被水解為小分子的氨基酸或多肽,使具有抗氧化活性的多肽數(shù)量減少,導(dǎo)致酶解液的抗氧化活性降低[14]。綜合兩個指標(biāo)的影響,可以選擇加酶量在4000～6000 U/g為考慮范圍。

圖3 加酶量對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.3 Effect of protease dosage on DH and DPPH radical scavenging capacity

2.2.3 酶解溫度對水解度和DPPH·清除率的影響 如圖4所示,在一定的溫度范圍內(nèi),溫度升高會使水解度增大,因為升溫會加速酶促反應(yīng);而繼續(xù)升溫則會導(dǎo)致水解度減小,堿性蛋白酶的最適溫度是45 ℃,因此溫度過高會使酶變性失活,不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。DPPH·清除率隨溫度的升高先增大后減小,這可能是由于每種蛋白酶都有其最適宜的反應(yīng)溫度,溫度過高或者過低都會影響蛋白質(zhì)水解成具有抗氧化活性的多肽。在55 ℃時,水解度和DPPH·清除率均達(dá)到最大,因此選擇溫度在50～60 ℃為考慮范圍。

圖4 酶解溫度對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on DH and DPPH radical scavenging capacity

2.2.4 pH對水解度和DPPH·清除率的影響 如圖5所示,隨著pH的增大,水解度和DPPH·清除率都是先增大后減小,這是因為堿性蛋白酶有其自身最適的pH,偏酸或偏堿都會破壞酶的構(gòu)象,影響其與底物的相互作用[15],從而對酶解過程產(chǎn)生不利影響。pH為8.5時,水解度最大,而pH為9時,DPPH·清除率最高,因此選擇pH在8～9為考慮范圍。

圖5 pH對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.5 Effect of pH on DH and DPPH radical scavenging capacity

2.2.5 酶解時間對水解度和DPPH·清除率的影響 如圖6所示,水解度隨著時間的增加而增大,在3 h時達(dá)到最大值為36.8%,隨后保持不變。這是由于當(dāng)?shù)孜餄舛群图用噶勘３植蛔儠r,隨著時間的增加,底物與酶充分反應(yīng),水解度逐漸保持穩(wěn)定。隨著時間的延長,DPPH·清除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,這可能是因為隨著時間的增加,原來具有抗氧化能力的多肽被再次切斷,使得其失去了原有的抗氧化活性[14]?？紤]到能源和成本等方面原因,選擇酶解時間為2.5 h。

圖6 酶解時間對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on DH and DPPH radical scavenging capacity

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗結(jié)果及方差分析

2.3.1 回歸模型方程的建立及顯著性分析 為了制備活性更高的香菇柄多肽,以DPPH·清除率為響應(yīng)值,在單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上,選取底物濃度、加酶量、酶解溫度以及pH四個對響應(yīng)值影響較大的因素,進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗,以探究堿性蛋白酶水解香菇柄蛋白的最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗設(shè)計與結(jié)果
Table 2 The design and results of response surface experiment

實(shí)驗號A底物濃度B加酶量C酶解溫度DpHDPPH·清除率(%)1011040422001-1517130-1-1048814-100-14792500-1-148986001133837100-14668800-11414390-110450410-1-100387311-10-10391212-1100389713-1010367014-1001359215101037011610-103513170000619118000062081900006172200-10-15684211100280122100131962301-103576240101363125010-14358260-101396027000059262800005939291-1004775

采用Design-Expert.8.0.6統(tǒng)計軟件對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,結(jié)果如表3所示,對各因素進(jìn)行多元擬合后得到的回歸方程為:

Y(%)=60.87-0.90A-4.48B-0.38C-6.39D-5.00AB+1.07AC-0.68AD+2.11BC+2.49BD-2.58CD-13.54A2-9.05B2-9.79C2-7.18D2,其中Y為DPPH·清除率,A、B、C、D分別代表底物濃度、加酶量、酶解溫度及pH。

由回歸方程的顯著性檢驗可知,模型中一次項B和D對DPPH·清除率的影響極顯著,A影響顯著;交互項AB、BC、BD及CD對DPPH·清除率的影響均是極顯著的;二次項的影響也都是極顯著的。根據(jù)回歸方程各因素絕對值的大小可知對DPPH·清除率影響的大小依次為:D>B>A>C。

2.3.2 響應(yīng)面分析以及最佳工藝參數(shù)的確定 根據(jù)Design Expert軟件得到的三維曲面圖,可以看出兩個因素交互作用對響應(yīng)值產(chǎn)生的影響。如圖7所示,當(dāng)?shù)孜餄舛?、加酶量、酶解溫度和pH中任意兩個因素為零水平時,剩下兩個因素均可對響應(yīng)值產(chǎn)生不同程度的影響。在圖7a中,控制酶解時間和pH為零水平,底物濃度和加酶量相互作用顯著。DPPH·清除率隨底物濃度和加酶量的增加均呈先上升后緩慢下降的趨勢,且加酶量的上升速度稍快于底物濃度的上升速度,說明加酶量對DPPH·清除率的影響較大,這與方差分析的結(jié)果一致。圖7b和圖7c中響應(yīng)面對應(yīng)的等高線呈圓形,說明底物濃度與酶解時間以及pH與底物濃度之間的交互作用不明顯。圖7d表示的是加酶量和酶解溫度對DPPH·清除率的影響,從等高線圖中可看出加酶量以及酶解溫度之間交互作用顯著。隨著酶解溫度的增加,DPPH·清除率的變化不大,說明酶解溫度對清除率的影響不大。圖7e表示的是pH和加酶量之間的交互作用,從響應(yīng)面圖的陡峭程度可以看出pH和加酶量對DPPH·清除率的影響均較大。圖7f表示的是酶解溫度和pH對DPPH·清除率的影響和兩者之間的交互作用,圖中顯示pH對自由基清除率的影響極為顯著。

表3 回歸模型及方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression equation

方差來源平方和自由度均方和F值p值顯著性模型270714141933713596<00001??A976197668600202?B2404912404916909<00001??C170117012002924D4897314897334433<00001??AB9980199807017<00001??AC462146232500930AD185118513002733BC177711777124900033??BD248512485174700009??CD266812668187600007??A2118928111892883618<00001??B25313315313337358<00001??C26211316211343672<00001??D23346813346823531<00001??殘差199114142失擬項11861011905907734凈誤差8054201總和27270628R2=09927R2Adj=09854CV=268%

圖7 各因素交互作用對DPPH·清除率的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots of variable parameters on DPPH radical scavenging rate

注:*,差異顯著(p<0.05);**,差異極顯著(p<0.01)。

2.3.3 驗證實(shí)驗 由模型方程計算可得,香菇柄蛋白酶解的最優(yōu)方案為:底物濃度2.04%、加酶量4673.42 U/g、pH為8.25、酶解溫度為55.07 ℃、酶解時間為2.5 h,DPPH·清除率理論值達(dá)到63.20%。根據(jù)實(shí)驗的實(shí)際情況和可操作性將酶解條件調(diào)整為:底物濃度2%、加酶量4700 U/g、pH為8.3、酶解溫度為55 ℃、酶解時間為2.5 h。在此條件下,實(shí)驗重復(fù)三次,最終得到的DPPH·清除率為62.02%,與理論值相差不大。說明基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化制備抗氧化肽的工藝參數(shù)是可靠的。

3 結(jié)論

選用五種蛋白酶對香菇柄蛋白進(jìn)行酶解,以DH和DPPH·清除率為指標(biāo),確定了堿性蛋白酶為水解香菇柄蛋白的最佳酶源。在單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到采用堿性蛋白酶水解香菇柄蛋白制備抗氧化肽的最佳條件為:底物濃度2%、加酶量4700 U/g、pH為8.3、酶解溫度為55 ℃。在酶解時間為2.5 h條件下制備的香菇柄抗氧化肽的DPPH·自由基清除率達(dá)到62.02%,而香菇柄多肽的其他理化性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。通過香菇柄多肽的制備,可以適當(dāng)解決目前香菇柄大量廢棄的問題,同時為研發(fā)新的香菇柄產(chǎn)品開辟途徑。

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Study on the preparation of antioxidant peptides by enzymatic hydrolysis of letinous edodes stalk protein

ZHANG Lu1,CAO Hui1,*,GONG Zhi-qing2,ZHANG Ting1,YU Man-man1,GE Lin-li1,WANG Wen-liang2

(1.College of Food Science and Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225000,China; 2.Institute of Agro-Food Science and Technology,Shandong Academy of Agricultural Science,Ji’nan 250100,China)

The protein fromlentinusedodesstalk was subjected to hydrolysis to prepare the antioxidant peptides,providing a theoretical basis for the deep processing of mushroom stem. Firstly,the protease was screened,then the single factor experiment was carried out on the basis of Alkaline protease. Four factors and three levels of response surface analysis were used to study the effects of substrate concentration,enzyme concentration,pH and temperature on the extraction process. DPPH scavenging capacity was used as the response value,the optimal conditions for the enzymatic hydrolysis technique were determined as follows:substrate concentration of 2%,enzyme concentration of 4700 U/g,pH8.3,hydrolysis temperature of 55 ℃,hydrolysis time of 2.5 h. Under these conditions,the DPPH scavenging ratio was 63.2%.Letinousedodesstalk polypeptide had a certain antioxidant activity,providing the basis for the development ofletinousedodesstalk products.

lentinusedodesstalk;protein;enzymatic hydrolysis;free radical scavenging rate;antioxidant peptides

2016-07-04

張璐(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與食品加工，營養(yǎng)食品加工研究，E-mail:anhuizhanglu55@163.com。

*通訊作者:曹暉(1968-)，女，博士，副教授，研究方向：營養(yǎng)與食品加工，果蔬加工研究，E-mail:yzcaohui@126.com。

山東省重點(diǎn)研發(fā)計劃(2015GNC110026)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)23-0233-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.035