鱸魚腸道Lactobacillussakei LY1-6對(duì)熒光假單胞菌抑制作用研究

馬歡歡,呂欣然,林 洋,孫夢(mèng)桐,白鳳翎,*,勵(lì)建榮

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

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鱸魚腸道LactobacillussakeiLY1-6對(duì)熒光假單胞菌抑制作用研究

馬歡歡1,呂欣然2,林 洋1,孫夢(mèng)桐1,白鳳翎1,*,勵(lì)建榮1

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

目的:從海魚腸道中篩選對(duì)熒光假單胞菌具有較強(qiáng)抑制作用的乳酸菌。方法:采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法篩選菌株,通過生理生化反應(yīng)和16S rRNA測(cè)序進(jìn)行菌株生物學(xué)鑒定,利用蛋白酶、pH和溫度等因素對(duì)抑菌活性進(jìn)行分析,采用掃描電鏡分析乳酸菌無細(xì)胞上清液(CFS)對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性影響。結(jié)果:從鱸魚腸道中篩選出對(duì)熒光假單胞菌具有較強(qiáng)抑制活性的菌株LY1-6,經(jīng)生理生化和16S rRNA測(cè)序鑒定為清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)。菌株LY1-6 CFS經(jīng)胃蛋白酶處理后其抑菌活性完全喪失,經(jīng)中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶處理后其抑菌活性分別喪失了38.22%、38.00%、22.48%和18.46%。在pH2.5～5.0具有抑菌活性,并具有良好的熱穩(wěn)定性,初步結(jié)果表明LY1-6 CFS中抑菌活性物質(zhì)可能為細(xì)菌素。掃描電鏡結(jié)果表明經(jīng)LY1-6 CFS處理使熒光假單胞菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞并溶解。結(jié)論:來自鱸魚腸道的清酒乳桿菌LY1-6對(duì)熒光假單胞菌具有較強(qiáng)抑制作用,其抑菌活性物質(zhì)為細(xì)菌素類,作用機(jī)制為破壞細(xì)胞的完整性,可作為控制水產(chǎn)品中熒光假單胞菌腐敗生物保鮮的出發(fā)菌株。

熒光假單胞菌,清酒乳桿菌LY1-6,海水魚腸道,篩選,水產(chǎn)品保鮮

熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)可引起低溫條件下的奶類、蛋類、肉類和魚類等食品的腐敗變質(zhì)[1]。劉永吉等[2]從冷卻豬肉中分離鑒定形成生物被膜能力較強(qiáng)的菌株P(guān)seudomonasfluorescens113,證實(shí)是引起肉類腐敗的特定腐敗菌。崔方超等[3]從冷藏大菱鲆體表分離獲得導(dǎo)致魚體腐敗的特定腐敗菌菌株P(guān)001,經(jīng)鑒定為Pseudomonasfluorescens。在低溫貯藏條件下,控制水產(chǎn)動(dòng)物和肉禽乳類食品中熒光假單胞菌具有重要應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)水產(chǎn)食品而言,生物防腐保鮮技術(shù)具有安全、無殘留和無損傷的優(yōu)勢(shì),一般采用動(dòng)植物提取物和微生物菌體及其代謝產(chǎn)物控制食品中致病和腐敗微生物的生長(zhǎng)繁殖。Kü?ükgülmez等[4]研究表明蝦殼中提取的殼聚糖對(duì)熒光假單胞菌具有較強(qiáng)的抑菌作用。趙前程等[5]采用果膠的酶解物可使冷藏大菱鲆魚肉貯藏期從1周延長(zhǎng)至2周。Rong等[6]利用Lactobacillusplantarum1.19可使羅非魚生魚片的貯藏期從24 h延長(zhǎng)到48 h。陳桂芳等[7]通過添加3 μL/mL肉桂油以抑制熒光假單胞菌群體感應(yīng)的方式延緩冷藏大菱鲆魚汁的腐敗,使貯藏時(shí)間延長(zhǎng)48 h。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品是拮抗性乳酸菌的重要來源,Liu等[8]從牦牛酸奶中篩選出對(duì)PseudomonasfluorescensAS1.1802具有較強(qiáng)抑制作用的菌株LactobacillusplantarumQ7。高鵬等[9]從酸菜中分離獲得LactobacillusplantarumHLJ-174,能有效抑制Pseudomonasfluorescens的生長(zhǎng)。天然魚類腸道也棲息著對(duì)細(xì)菌具有拮抗活性的乳酸菌,Kaynar等[10]從紅鯛魚腸道中分離獲得菌株LactobacillusxylosusHC9對(duì)目標(biāo)菌BacillusmegateriumP4具有較強(qiáng)的抑制作用?？婅礆g等[11]從鯉魚腸道中分離篩選出對(duì)EscherichiacoliO157∶H7具有較強(qiáng)拮抗活性的菌株Lactobacillussakei和Lactobacillusplantarum。然而,從鱸魚腸道中分離拮抗性乳酸菌的研究偏少,對(duì)海洋魚類中乳酸菌資源還有待于開發(fā)。

大菱鲆是我國(guó)重要的海產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類,由于缺乏有效的冷鮮保藏技術(shù),目前主要以鮮售為主,限制了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文從鱸魚、刀魚、牙鲆、大菱鲆等海水魚腸道中分離篩選出對(duì)熒光假單胞菌具有較強(qiáng)拮抗作用的乳酸菌菌株,并對(duì)其拮抗性能進(jìn)行研究,旨在為冷藏大菱鲆防腐保鮮提供優(yōu)良生物防腐菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱸魚、刀魚、牙鲆、大菱鲆 遼寧省錦州市金凌商場(chǎng)。

指示菌:單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19115、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)ATCC BB-170 美國(guó)典型菌種保藏中心;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC26003、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)CMCC63301 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心;嗜冷桿菌(Psychrobactersp.)MCCC1A00052 中國(guó)實(shí)驗(yàn)室微生物菌種購買保藏中;熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)P001、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)L002 分離自大菱鲆。

MRS瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA marker-D、Taq PCR Master mix 上海生工生物工程有限公司;乳酸菌生理生化鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司;胃蛋白酶(15000 U/g)、胰蛋白酶(250000 U/g)、木瓜蛋白酶(200000 U/g)、中性蛋白酶(200000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g) 華藍(lán)化學(xué)有限公司。

DL-CJ-2N型超級(jí)潔凈工作臺(tái) 東聯(lián)哈爾(北京)儀器制造有限公司;賽福智能生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠;BMM-408YS顯微鏡 上海澮統(tǒng)光學(xué)儀器有限公司;5804R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;Mastercycler pro梯度PCR儀 德國(guó)艾本德股份有限公司;DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠;Cheimdox XRS 凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司;GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;E-1045鍍金儀、S-4800掃描電鏡 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海魚腸道中乳酸菌的分離 分別稱取10.00 g鱸魚、刀魚、牙鲆和大菱鲆的腸道,剪成長(zhǎng)約2 cm片段,置于裝有90 mL無菌水的三角瓶中,充分震蕩,靜置10 min。吸取100 μL在1% CaCO3MRS瓊脂平板上涂布,37 ℃培養(yǎng)48 h,挑選有溶鈣圈的白色菌落進(jìn)行純化。挑取純化培養(yǎng)后的單個(gè)菌落進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)和革蘭氏染色初篩乳酸菌菌株。

1.2.2 指示菌菌懸液制備 將-80 ℃保存的8株指示菌以0.5%的接種量于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)12 h,活化3代,用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋使其菌懸液最終濃度為106CFU/mL,后置于4 ℃冰箱備用。

1.2.3 抗熒光假單胞菌乳酸菌的篩選 取初篩乳酸菌菌株培養(yǎng)24 h的菌懸液10 mL,經(jīng)4 ℃ 8000 r/min離心10 min,吸取上清液經(jīng) 0.45 μm濾器過濾獲得乳酸菌無細(xì)胞上清液(cell free supernatant,CFS)。參照等[12]利用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法應(yīng)用菌株CFS對(duì)熒光假單胞菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 乳酸菌菌株抑菌譜測(cè)定 利用從鱸魚、刀魚、牙鲆和大菱鲆的腸道中篩選出的乳酸菌菌株CFS對(duì)8株指示菌按1.2.3方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 乳酸菌菌株鑒定

1.2.5.1 生理生化鑒定 參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)中乳酸菌的鑒定方法進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)[13-15]。

1.2.5.2 16S rRNA鑒定 吸取1.0 mL乳酸菌菌株12 h菌懸液加入1.5 mL EP管中,4 ℃ 12000 r/min離心5 min,采用DNA快速抽提試劑盒提取菌株DNA,以16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物為27 f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),反向引物為1492 r(5′-TACGGYTACCTTTGTT ACGACTT-3′),引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為DNA模板1.0 μL、Taq PCR Master mix 12.5 μL、dd H2O 9.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL,總體積25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性1 min,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s,72 ℃保持10 min,循環(huán)30次,4 ℃保溫。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,觀察凝膠成像系統(tǒng)的擴(kuò)增效果并照相。將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)校對(duì)后與NCBI上GeneBank數(shù)據(jù)庫中的己有序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.6 乳酸菌生長(zhǎng)與抗熒光假單胞菌活性曲線分析 取200 μL乳酸菌菌懸液接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)。每隔4 h取樣測(cè)定菌懸液OD600值和pH,并按照1.2.3測(cè)定菌株CFS的抑菌活性。

1.2.7 影響乳酸菌CFS抑制熒光假單胞菌的因素 酶敏感實(shí)驗(yàn):將乳酸菌CFS分別用1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L HCl調(diào)至酶的最佳pH(胃蛋白酶pH2.0、胰蛋白酶pH7.5、木瓜蛋白酶pH7.0、中性蛋白酶pH7.0和堿性蛋白酶pH10.0),添加蛋白酶使其在乳酸菌CFS中的終濃度為1.0 mg/mL,37 ℃水浴中孵育2 h,將蛋白酶處理后的CFS pH調(diào)至初始值,同時(shí)以乳酸菌CFS作對(duì)照,參照1.2.3進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

pH實(shí)驗(yàn):用1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L HCl將乳酸菌CFS pH分別調(diào)至2.5、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5,同時(shí)用相同方法相對(duì)應(yīng)pH MRS液體培養(yǎng)基作對(duì)照,按1.2.3方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取乳酸菌CFS分別經(jīng)40、60、80、100和121 ℃處理30 min,同時(shí)以菌株CFS作對(duì)照,按1.2.3方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 乳酸菌CFS處理熒光假單胞菌細(xì)胞掃描電鏡分析 參考Hovnanyan等[16]的方法并稍作修改。取1 mL含有106CFU/mL熒光假單胞菌菌懸液4 ℃12000 r/min離心5 min,棄上清液,菌體生理鹽水洗滌3次,每次5 min,后加入乳酸菌CFS,未添加CFS為對(duì)照,30 ℃靜置培養(yǎng)12 h。4 ℃ 12000 r/min離心5 min 收集熒光假單胞菌菌體。將菌體在2.5%戊二醛溶液中4 ℃過夜,用0.1 mol/L pH7.2 PBS 洗滌2次,每次5 min洗去殘留的戊二醛。分別用40%、70%、90%、100%乙醇對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行脫水處理15 min,將菌體滴加在蓋玻片上,自然晾干,噴金,掃描電鏡觀察。

1.2.9 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次,數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌菌株的分離

從鱸魚、刀魚、牙鲆和大菱鲆魚腸道中篩選出具有溶鈣圈、過氧化氫酶陰性和革蘭氏染色陽性的49株乳酸菌,四種海魚腸道的乳酸菌菌株數(shù)分別為15、13、12和9,以海魚中文名稱首字母和分離順序進(jìn)行命名。

2.2 拮抗性乳酸菌的篩選

利用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法從49株菌株中篩選出7株對(duì)熒光假單胞菌具有較強(qiáng)抑制活性的菌株,抑菌直徑均大于12.00 mm,分別為YP1-6、YP4-5、LP2-4、DY1-3、DY3-2、LY2-4和LY1-6。圖1中A為5株乳酸菌CFS對(duì)熒光假單胞菌的抑菌效果,從中可以看出菌株LY1-6和DY3-2的抑菌圈較大,YP1-6次之,YP4-5和LY1-3抑菌圈較小。B圖為7株乳酸菌CFS對(duì)熒光假單胞菌的抑菌結(jié)果,從中可看出菌株LY1-6的CFS抑菌效果最好,抑菌直徑為18.90 mm,因此,選取菌株LY1-6進(jìn)行下一步研究。

圖1 乳酸菌對(duì)熒光假單胞菌的抑制作用和效果Fig.1 Antagonistic effect of LAB on P. fluorescens

2.3 乳酸菌抑菌譜測(cè)定

不同來源的乳酸菌代謝過程中形成的抑菌活性物質(zhì)抑菌譜不同。表1是篩選菌株LY1-6 CFS對(duì)8株指示菌的抑菌結(jié)果,從中可看出菌株LY1-6對(duì)革蘭氏陽性菌(G+)抑菌效果較差,抑菌直徑均低于15 mm;菌株LY1-6 CFS對(duì)革蘭氏陰性菌(G-)抑菌效果較好,抑菌直徑均高于15 mm,其中對(duì)熒光假單胞菌和哈維氏弧菌的抑菌效果最好,抑菌直徑分別為18.95 mm和18.86 mm。結(jié)果表明,菌株LY1-6 CFS中抑菌活物質(zhì)不具較廣的抑菌譜,而對(duì)G-細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制作用。

表1 菌株LY1-6對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌抑菌結(jié)果
Table 1 Results of strain LY1-6 against gram positive bacteria and gram negative bacteria

G+抑菌直徑(mm)G-抑菌直徑(mm)單核細(xì)胞增生李斯特菌1368±013銅綠假單胞菌1626±021金黃色葡萄球菌-熒光假單胞菌1895±024嗜冷桿菌1301±022溫和氣單胞菌1755±019蠟樣芽孢桿菌1487±017哈維氏弧菌1886±017

注:“-”為無抑菌作用。

表2 菌株LY1-6生理生化鑒定結(jié)果
Table 2 Physiological and biochemical test results of strain LY1-6

項(xiàng)目LY1-6項(xiàng)目LY1-6項(xiàng)目LY1-6阿拉伯糖+麥芽糖+葡萄糖酸鹽-纖維二糖-甘露醇-乳糖-七葉靈-甘露糖+木糖-果糖+松三糖-鼠李糖-半乳糖+蜜二糖+山梨醇-葡萄糖+棉籽糖-蔗糖+

注:“+”表示陽性;“-”表示陰性。

2.4 乳酸菌菌株鑒定

2.4.1 生理生化鑒定 表2為篩選菌株LY1-6生理生化鑒定結(jié)果,依照文獻(xiàn)[13]可初步判定菌株LY1-6為乳桿菌屬的Lb.sakei。

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定 圖2為菌株LY1-6 PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離結(jié)果,從中可看出菌株在1500 bp左右出現(xiàn)熒光條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析菌株LY1-6 16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1459 bp。

圖2 菌株LY1-6的16S rRNA基因擴(kuò)增電泳圖Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA gene of strain LY1-6

菌株同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹建立:將菌株LY1-6的測(cè)序結(jié)果通過MEGA5.05軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中乳桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果如圖3所示,菌株LY1-6與3株標(biāo)準(zhǔn)菌株Lb.sakei在同一分支上,且四株菌的同源性很高,可確定菌株LY1-6為L(zhǎng)b.sakei。

圖3 菌株LY1-6的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree for sequences of strain LY1-6

2.5 乳酸菌生長(zhǎng)與拮抗活性曲線

乳酸菌在生長(zhǎng)過程中形成乳酸等酸性物質(zhì)和一些拮抗性代謝產(chǎn)物,對(duì)霉菌、細(xì)菌等微生物生長(zhǎng)具有抑制作用[17]。圖4為菌株LY1-6經(jīng)37 ℃靜置培養(yǎng)48 h的生長(zhǎng)曲線及對(duì)熒光假單胞菌抑菌活性的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果。從中可以看出,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)pH呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì),在16 h呈水平發(fā)展。從培養(yǎng)至8 h LY1-6 CFS表現(xiàn)出對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)具有的抑菌作用,培養(yǎng)12 h細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期,當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)到24 h時(shí)抑菌活性達(dá)到最大值,后期呈穩(wěn)定狀態(tài)。結(jié)果表明乳酸菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定期時(shí),其拮抗性代謝產(chǎn)物已經(jīng)形成。因此,選擇24 h為菌株LY1-6抑菌活性研究的最佳時(shí)間。

2.6 影響乳酸菌CFS抑制熒光假單胞菌的因素

2.6.1 酶敏感性實(shí)驗(yàn) 乳酸菌代謝產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)包括乳酸菌素、羅伊氏菌素和雙乙酰等代謝產(chǎn)物,蛋白酶敏感性測(cè)定是影響抑菌活性物質(zhì)的主要因素之一[17]。表3是LY1-6 CFS經(jīng)胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶處理后對(duì)熒光假單胞菌抑菌結(jié)果,從中可以看出,經(jīng)蛋白酶處理后抑菌活性出現(xiàn)不同程度的降低或喪失。胃蛋白酶處理后抑菌活性完全喪失,表明菌株LY1-6 CFS中抑菌物質(zhì)對(duì)胃蛋白酶具有較強(qiáng)的敏感性。經(jīng)中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶處理后抑菌活性分別喪失了38.22%、38.00%、22.48%和18.46%,表明LY1-6對(duì)這4種蛋白酶具有不同程度的敏感性?？婅礆g等[11]研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillusplantarum代謝產(chǎn)生具有抑制大腸桿菌O157∶H7的細(xì)菌素,經(jīng)胃蛋白酶處理后抑菌活性喪失,可初步判定其抑菌物質(zhì)中有蛋白類物質(zhì)。

表4 不同pH對(duì)菌株CFS抑菌活性的影響
Table 4 Effects of pH on the anti-bacterial activity of CFS

組別抑菌圈直徑(mm)2535455055CFS2265±0172049±0211568±0141132±023-MRS1618±0541298±027---

圖4 菌株LY1-6的生長(zhǎng)及拮抗活性曲線Fig.4 The growth and antagonistic activity curve of strain LY1-6

注:“-”為無抑菌作用。

表3 蛋白酶處理對(duì)菌株CFS抑菌活性的影響
Table 3 Effects of proteases treatment on the anti-bacterial activity of CFS

蛋白酶抑菌圈直徑(mm)活性喪失率(%)胃蛋白酶-100中性蛋白酶1142±0183822木瓜蛋白酶1138±0683800胰蛋白酶1423±0692248堿性蛋白酶1502±0831846對(duì)照組1842±0500

注:“-”為無抑菌作用。

2.6.2 pH實(shí)驗(yàn) pH是影響乳酸菌CFS抑菌活性的主要因素,表4是不同pH下菌株LY1-6 CFS和MRS對(duì)熒光假單胞菌的抑制作用結(jié)果。從中可以看出,抑菌直徑隨pH上升呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)pH2.5～3.5時(shí),兩組實(shí)驗(yàn)中均具有抑菌作用;當(dāng)pH4.5～5.0時(shí),菌株LY1-6 CFS對(duì)熒光假單胞菌仍具有抑制作用,對(duì)照組抑菌活性完全喪失;當(dāng)pH5.5～6.5時(shí),抑菌活性均已完全喪失(表中未列出)。結(jié)果表明,菌株LY1-6 CFS中抑菌活性物質(zhì)部分來自酸環(huán)境,同時(shí)還存在其他抗菌成分。

2.6.3 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 溫度是影響乳酸菌CFS抑菌活性的主要因素,從圖5可以看出,40、60、80、100和121 ℃處理30 min后的菌株LY1-6 CFS抑菌直徑呈平穩(wěn)狀態(tài),結(jié)果表明,菌株LY1-6 CFS中的抑菌活性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性。Gómez等[18]從鱈魚、沙丁魚和虹鱒魚等水產(chǎn)品中分離獲得產(chǎn)細(xì)菌素Pediococcusacidilactici、Lactococcuspiscium和Lactobacillussakei等乳酸菌菌株,乳酸菌CFS經(jīng)65、75、100和121 ℃處理后仍具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖5 熱處理對(duì)菌株CFS抑菌活性的影響Fig.5 Effects of thermal treatment on the anti-bacterial activity of CFS

2.7 乳酸菌CFS處理熒光假單胞菌細(xì)胞掃描電鏡分析

圖6 LY1-6 CFS對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effect of LY1-6 CFS on the cells structure of P. fluorescens

拮抗性乳酸菌通過形成酸性物質(zhì)、拮抗性次級(jí)代謝產(chǎn)物等以破壞細(xì)胞膜的完整性殺傷受試細(xì)菌,從而達(dá)到抑菌和殺菌的作用效果[19]。圖6為L(zhǎng)Y1-6 CFS對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞進(jìn)行處理,通過觀察受試細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的變化,分析其拮抗作用方式。從中可以看出,對(duì)照組的熒光假單胞菌細(xì)胞形態(tài)完整,胞膜平滑,兩端圓鈍。當(dāng)加LY1-6 CFS時(shí),熒光假單胞菌細(xì)胞的完整性破壞,細(xì)胞膜出現(xiàn)褶皺并溶解。表明菌株LY1-6 CFS對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜具有破壞作用,從而抑制熒光假單胞菌的生長(zhǎng),結(jié)果與Necima等[17]的研究一致。

3 結(jié)論

乳酸菌是傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品的主體微生物類群,也來自哺乳動(dòng)物、鳥類和低等脊椎動(dòng)物的腸道。本文從海鱸魚腸道中分離對(duì)熒光假單胞菌具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株Lb.sakeiLY1-6,研究發(fā)現(xiàn)其抑菌作用對(duì)酸性環(huán)境具有良好的耐受性并對(duì)熱處理穩(wěn)定,初步判斷抑菌活性物質(zhì)可能為蛋白類細(xì)菌素。本研究一方面拓展了拮抗性乳酸菌的生物資源,另一方面利用來源和應(yīng)用相似相容原則,針對(duì)引起大菱鲆腐敗的特定腐敗菌熒光假單胞菌進(jìn)行抑菌作用研究。利用該菌株研發(fā)一種生物防腐劑,為控制海產(chǎn)品冷藏保鮮過程中熒光假單胞菌導(dǎo)致的腐敗變質(zhì)和延長(zhǎng)冷藏產(chǎn)品的貨架期奠定基礎(chǔ)。

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Inhibitory activity of Lactobacillus sakei LY1-6 from perch intestine against Pseudomonas fluorescens

MA Huan-huan1,LV Xin-ran2,LIN Yang1,SUN Meng-tong1,BAI Feng-ling1,*,LI Jian-rong1

(1.College of Food Science and Technology,Bohai University;Food Safety Key Lab of Liaoning Province; National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products;Jinzhou 121013,China; 2.College of Biology Science and Technology,Beijing Forest University,Beijing 100083,China)

Objective:To isolate lactic acid bacteria(LAB)from marine fish intestine with strong antagonistic activity againstPseudomonasfluorescens. Methods:LAB strains with inhibitory activity againstP.fluorescenswere screened using the method of Oxford cup agar diffusion. The strains were identified by biochemical tests and 16S rRNA sequence analysis. The antibacterial substance was determined using protease sensitivity test,pH test and heat-treated test. The integrity of cell structure ofP.fluorescenstreated with cell-free supernatants(CFS)of produced by LY1-6 was observed by scanning electron microscope. Results:Strain LY1-6 with outstanding inhibitory activity againstP.fluorescenswas screened from ocean perch intestine,and was identified asLactobacillussakei. The inhibitory activity of LY1-6 CFS was completely lost by treated with pepsin,meanwhile,when treated with neutral protease,papaya protease,trypsin and alkaline protease,the inhibitory activity lost 38.22%,38.00%,22.48% and 18.46% respectively. The inhibitory substance was effective within pH2.5～5.0 and stability after thermal treatment,which was preliminary determined as bacteriocins. The scanning electron microscope images revealed that the integrity of cell ofP.fluorescenstreated with LY1-6 CFS was damaged and dissolved. Conclusion:LactobacillussakeiLY1-6 with strong inhibitory activity againstP.fluorescenswas screened from ocean perch intestine. Moreover,its antibacterial substance was determined as bacteriocins. The mechanism of action was destruction the integrity of cell.Lb.sakeiLY1-6 biological preservative can be used as starting strain for the control ofP.fluorescensin aquatic products spoilage.

Pseudomonasfluorescens;LactobacillussakeiLY1-6;marine fish intestine;screening;seafood preservative

2016-07-04

馬歡歡(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制，E-mail：mahuanhuan14@163.com。

*通訊作者:白鳳翎(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制和食品微生物學(xué)，E-mail：baifling@163.com。

遼寧省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目(2015103020)；泰山學(xué)者藍(lán)色產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才團(tuán)隊(duì)支撐計(jì)劃項(xiàng)目(魯政辦字(2015)19號(hào)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)23-0150-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.020