喀斯特山區(qū)2個(gè)鯽魚群體基于轉(zhuǎn)鐵蛋白的遺傳多樣性研究

周其椿，安 苗，王金娜，郭健康，楊 興，李建光

(1.貴州省水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.正安縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，貴州 正安 563400)

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喀斯特山區(qū)2個(gè)鯽魚群體基于轉(zhuǎn)鐵蛋白的遺傳多樣性研究

周其椿1，安 苗2*，王金娜3，郭健康2，楊 興1，李建光1

(1.貴州省水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.正安縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，貴州 正安 563400)

為了解喀斯特山區(qū)2個(gè)不同鯽魚群體在蛋白質(zhì)水平的遺傳多樣性及其遺傳差異，運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對喀斯特山區(qū)2個(gè)群體鯽魚的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白電泳表型及多樣性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：群體克隆多樣性指數(shù)表現(xiàn)為草海鯽魚(0.32)﹥紅鯽(0.25，對照)﹥普安鯽魚(0.13)；3個(gè)鯽魚群體的13個(gè)克隆由9個(gè)不同的等位基因產(chǎn)生，等位基因的頻率分別為Tfa0.144 9、Tfb0.202 9、Tfc0.036 2、Tfd0.058 0、Tfe0.007 2、Tff0.239 1、Tfg0.014 5、Tfh0.275 4、Tfi0.029 0；普安鯽魚與草海鯽魚和紅鯽無共享的基因型；普安鯽魚與草海鯽魚之間的遺傳相似性指數(shù)較高(0.714 3)，遺傳距離較小(0.285 7)。總體來看，草海鯽魚的克隆多樣性水平較高，其轉(zhuǎn)鐵蛋白多樣性程度較普安鯽魚豐富；2個(gè)群體之間存在較近的親緣關(guān)系，未達(dá)到遺傳距離種的分化標(biāo)準(zhǔn)。

喀斯特山區(qū)； 鯽魚； 轉(zhuǎn)鐵蛋白； 遺傳多樣性

鯽(Carassiusauratus) 隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鯉亞科(Cyprininae)、鯽屬(Carassius)，是我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類，具有廣泛的地理分布、眾多的地方群體及豐富的遺傳多樣性。我國有2個(gè)種和1個(gè)亞種，即普通鯽魚(C.auratus)、黑鯽(C.caraussius)和銀鯽亞種(C.auratusgibelio)。貴州省地處西部高寒喀斯特山區(qū)，因其獨(dú)特的地質(zhì)地貌和氣候條件，在漫長進(jìn)化過程中，孕育了一批獨(dú)特的地方性鯽魚群體，如分布于西南部普安縣青山鎮(zhèn)一帶山塘水體中(屬南盤江水系，海拔1 650 m)的普安鯽魚(C.auratus)和西北部威寧縣草海國家級自然保護(hù)區(qū)(屬金沙江水系，湖底海拔2 171.7 m)的草海鯽魚(C.auratus)。

轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，簡稱Tf)是一種能夠在機(jī)體內(nèi)緊密且可逆地結(jié)合2個(gè)Fe3+、參與鐵的運(yùn)輸和清除、直接關(guān)系到氧的利用和代謝的一種蛋白質(zhì)。自Smithies等[1]首次在人血清中發(fā)現(xiàn)Tf的多態(tài)性以來，Tf的多態(tài)性在多種魚類的血清中也得到證實(shí)。魚類Tf僅存在于魚類血清中，不受水溫影響，與棲息水層有關(guān)[2]。同一品種魚血清Tf的多態(tài)性、含量、活性及其基因頻率和基因型頻率等具有一定的穩(wěn)定性，而不同種屬、品種(品系)魚的血清Tf有很大差異[2-3]。魚類血清Tf已被眾多學(xué)者廣泛運(yùn)用于養(yǎng)殖、野生魚類的種質(zhì)鑒定和種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，并取得許多重要成果[2-6]。為更好地了解喀斯特山區(qū)鯽魚群體的種質(zhì)特性和遺傳差異，對喀斯特山區(qū)2個(gè)鯽魚群體的血清Tf多態(tài)性進(jìn)行研究，以期揭示2個(gè)群體鯽魚在蛋白質(zhì)水平的遺傳多樣性及其遺傳差異，為其選育和保護(hù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

普安鯽魚采自貴州省普安縣普安銀鯽原種場飼養(yǎng)的后備親魚群體，草海鯽魚采自貴州省威寧縣草海湖泊的羊關(guān)山、鄧家院子、潘家院子3個(gè)站點(diǎn)，對照紅鯽采自貴州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場。供試魚均為從漁獲物混合群體中隨機(jī)挑選的活潑健康個(gè)體，采用塑料袋密封充氧運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室水族箱暫養(yǎng)。3個(gè)群體基本情況見表1。從魚體尾靜脈取血0.8～1.0 mL，4 ℃靜置5～10 min，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)魚的樣本數(shù)、體長及體質(zhì)量

1.2 Tf樣品制備及電泳

參照楊林[4]的方法純化血清Tf，采用北京六一儀器公司DYCZ-21 型垂直電泳槽進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。電極緩沖液為Tris(0.025 mol/L)-甘氨酸(0.192 mol/L)緩沖系統(tǒng)(pH值 8.3)，濃縮膠含量為5%，電壓為160 V，分離膠含量為8%，電壓為200 V，上樣量為10 ～15 μL，0.2%的溴酚藍(lán)作指示劑，電泳時(shí)間約4 h。電泳結(jié)束后，將膠轉(zhuǎn)入染缸中，清水沖洗，用0.2%的考馬斯亮藍(lán)R-250溶液(100 mL溶液中含0.2 g R-250、45 mL甲醇、10 mL冰乙酸、45 mL水)進(jìn)行染色，用脫色劑(水、甲醇、冰乙酸溶液，體積比為5∶5∶1)對其進(jìn)行脫色至背景清晰。

1.3 Tf電泳圖譜的鑒定和多樣性計(jì)算

參照李風(fēng)波等[5]的方法鑒定每個(gè)群體鯽魚的克隆組成，即每一種表型代表一種克隆。通過對每尾鯽魚的血清Tf表型進(jìn)行重復(fù)電泳檢測，比對每尾鯽魚的Tf電泳表型并進(jìn)行表型克隆的判定，其克隆類型表示為C1、C2、C3…，計(jì)算其克隆多樣性指數(shù)(克隆數(shù)/樣品數(shù))。為進(jìn)一步驗(yàn)證3個(gè)群體鯽魚不同克隆之間的相互遺傳關(guān)系，將鑒定出來的15個(gè)克隆樣品在同一膠板進(jìn)行反復(fù)電泳對照；參照周秋白等[6]的方法進(jìn)行Tf對應(yīng)的基因和座位的命名，即Tf對應(yīng)的基因和座位用斜體字母表示(如Tfa)，多個(gè)等位基因依其電泳遷移速度的減小依次用小寫字母表示(如a、b、c…)。并計(jì)算基因型頻率、基因頻率、遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離。

基因型頻率=特定基因型個(gè)體數(shù)/測定個(gè)體總數(shù)；

基因頻率=特定等位基因出現(xiàn)數(shù)/測定個(gè)體所有等位基因出現(xiàn)總數(shù)；

遺傳相似性指數(shù)(I)和遺傳距離(D)計(jì)算公式為：

I=2Nij/(Ni+Nj)

D=1-I

式中，Nij是鯽魚群體i和j之間共同的等位基因數(shù)，Ni、Nj分別是鯽魚群體i和j全部的等位基因數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)群體鯽魚血清Tf的PAGE表型及克隆組成

圖1是32尾普安鯽魚血清Tf的PAGE表型(圖1a)和克隆組成(圖1b)。32尾普安鯽魚共鑒定出4個(gè)克隆，其中有1尾為克隆C1，有25尾共享克隆C2，4尾為克隆C3，另有2尾為克隆C4。通過計(jì)算可知，其群體克隆多樣性指數(shù)為0.13。

圖2是25尾草海鯽魚血清Tf的PAGE表型(圖2a)和克隆組成(圖2b)。25尾草海鯽魚共鑒定出8個(gè)克隆，其中有1尾為克隆C1，有1尾為克隆C2，2尾為克隆C3，12尾為克隆C4，有6尾共享克隆C5，1尾為克隆C6，1尾為克隆C7，1尾為克隆C8。通過計(jì)算可知，群體克隆多樣性指數(shù)為0.32。

圖3是12尾紅鯽血清Tf的PAGE表型(圖3a)和克隆組成(圖3b)。12尾紅鯽共鑒定出3個(gè)克隆，其中有1尾為克隆C1，有3尾共享克隆C2，剩余的8尾為克隆C3。通過計(jì)算可知，克隆多樣性指數(shù)為0.25。

1—32分別為32尾普安鯽魚; a為PAGE結(jié)果; b為克隆組成。下同

圖2 草海鯽魚血清Tf的PAGE結(jié)果及克隆組成

圖3 紅鯽血清Tf的PAGE結(jié)果及克隆組成

2.2 3個(gè)群體鯽魚的基因型頻率和基因頻率

從圖4可以看出，草海鯽魚的克隆C7與紅鯽的H2屬相同的圖譜，草海鯽魚的克隆C5與紅鯽的H3屬相同的圖譜，故共計(jì)有13個(gè)克隆。

圖中C1—C8代表草海鯽魚的8個(gè)克??；P1—P4代表普安鯽魚的4個(gè)克??；H1—H3代表紅鯽的3個(gè)克隆

本研究鑒定出的13個(gè)克隆共有Tfa、Tfb、Tfc、Tfd、Tfe、Tff、Tfg、Tfh和Tfi9個(gè)不同的等位基因(圖4)，其中，Tfe、Tfg為草海鯽魚特有的等位基因，Tfi為普安鯽魚特有的等位基因，草海鯽魚與普安鯽魚共享Tfa、Tfb、Tfd、Tff和Tfh5個(gè)等位基因。草海鯽魚與紅鯽共享等位基因Tfc，Tff為3個(gè)群體所共享等位基因。等位基因的頻率分別為Tfa0.144 9、Tfb0.202 9、Tfc0.036 2、Tfd0.058 0、Tfe0.007 2、Tff0.239 1、Tfg0.014 5、Tfh0.275 4、Tfi0.029 0(表2)。

表2 鯽魚群體等位基因頻率

3個(gè)群體69尾個(gè)體共有13個(gè)基因型，Tfadf、Tfbh、Tfadi、Tfdd、Tfbb、Tfde、Tfabg、Tfafh、Tfff、Tfaf、Tfcf、Tffh、Tfcc?；蛐皖l率分別為Tfadf0.014 5、Tfbh0.362 3、Tfadi0.057 9、Tfdd0.029 0、Tfbb0.014 5、Tfde0.014 5、Tfabg0.029 0、Tfafh0.174 0、Tfff0.202 9、Tfaf0.014 5、Tfcf0.057 9、Tffh0.014 5、Tfcc0.014 5(表3)。

32尾普安鯽魚鑒定出來的4個(gè)不同克隆的基因型主要是由6個(gè)等位基因Tfa、Tfb、Tfd、Tff、Tfh、Tfi分布頻率不同產(chǎn)生的?？寺1的基因型為Tfadf、克隆C2的基因型為Tfbh、克隆C3的基因型為Tfadi、克隆C4的基因型為Tfdd；25尾草海鯽魚鑒定出來的8個(gè)不同克隆的基因型主要是由Tfa、Tfb、Tfc、Tfd、Tfe、Tff、Tfg、Tfh8個(gè)不同的等位基因分布頻率不同產(chǎn)生的，克隆C1的基因型為Tfbb、克隆C2的基因型為Tfde、克隆C3的基因型為Tfabg、克隆C4的基因型為Tfafh、克隆C5的基因型為Tfff、克隆C6的基因型為Tfaf、克隆C7的基因型為Tfcf、克隆C8的基因型為Tffh；12尾紅鯽鑒定出來的3個(gè)克隆的基因型僅由Tfc、Tff2個(gè)等位基因分布頻率不同產(chǎn)生，克隆C1的基因型為Tfcc、克隆C2的基因型為Tfcf、克隆C3的基因型為Tfff。草海鯽魚與紅鯽之間共享2個(gè)基因型Tfff和Tfcf。普安鯽魚與草海鯽魚和紅鯽之間無共享的基因型。

表3 鯽魚群體基因型分布及頻率

注：括號內(nèi)的數(shù)字為基因型個(gè)數(shù)。

2.3 3個(gè)群體鯽魚的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離

遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離是衡量物種間親緣關(guān)系的重要指標(biāo)。從表4可以看出，普安鯽魚與草海鯽魚之間的遺傳相似性指數(shù)較高(0.714 3)，遺傳距離較小(0.285 7)，表明兩者之間存在較近的親緣關(guān)系，未達(dá)到遺傳距離種(0.3)的分化標(biāo)準(zhǔn)，而普安鯽魚與紅鯽間的遺傳距離(0.750 0)高于草海鯽魚與紅鯽間的遺傳距離(0.555 6)。

表4 鯽魚群體遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離

注：右上角為遺傳相似性指數(shù)，左下角為遺傳距離。

3 結(jié)論與討論

3.1 2個(gè)地方鯽魚群體Tf電泳表型

有關(guān)鯽魚血清Tf的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，由于多個(gè)等位基因造成Tf表型在品系間存在一定的差異[5-7]。本研究中，2個(gè)鯽魚群體血清Tf也存在多個(gè)等位基因，普安鯽魚有6個(gè)等位基因，草海鯽魚有8個(gè)等位基因，2個(gè)群體鯽魚存在3個(gè)特有的等位基因Tfe、Tfi和Tfg，Tfe和Tfg為草海鯽魚所特有，Tfi為普安鯽魚所特有。正是由于Tfe、Tfi和Tfg等位基因在群體間的差異性分布造成2個(gè)群體鯽魚的Tf表型在群體間均存在著一定的差異。

同時(shí)，本研究中普安鯽魚鑒定的克隆C2和克隆C4與安苗等[8]研究中的克隆C4和克隆C6表型完全一致，再次說明Tf在鯽魚同一群體克隆鑒別中具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

3.2 2個(gè)地方鯽魚群體克隆多樣性

由于Tf多態(tài)性在魚類中廣泛存在，克隆多樣性作為衡量群體遺傳多樣性的指標(biāo)已被廣泛應(yīng)用。本研究中普安鯽魚的克隆多樣性為0.13，略低于安苗等[8]對普安鯽魚的研究報(bào)道中的克隆多樣性指數(shù)(0.16)，與其研究中側(cè)線鱗為31的普安鯽魚的多樣性指數(shù)(0.14)較為相近，究其原因可能與采集的樣本有關(guān)，本研究采集的樣品為普安鯽魚后備親魚，而普安鯽魚原種場近年來后備親魚選育以側(cè)線鱗30或30以上為標(biāo)準(zhǔn)。

25尾草海鯽魚克隆數(shù)高達(dá)8種，群體克隆多樣性指數(shù)為0.32，與國內(nèi)外其他鯽魚群體比較，其多樣性遠(yuǎn)高于方正銀鯽(0.2)[4]、關(guān)東鯽(0.13)[9]、淇河鯽(0.14)[10]和額爾齊斯河銀鯽(0.15)[11]等，略低于伊犁河鯽魚(0.39)[6]和武漢長江江段鯽魚(0.42)[11]。

總體來看，草海鯽魚的克隆多樣性水平較高，其Tf多樣性程度較普安鯽魚的后備親本豐富。

3.3 2個(gè)地方鯽魚群體遺傳及變異

本研究中2個(gè)群體鯽魚也存在著一定的差異，32尾普安鯽魚共有4種基因型，而25尾草海鯽魚則多達(dá)8種基因型，并且群體間的基因型均不相同。

等位基因方面，兩群體鯽魚共享5個(gè)不同的等位基因，但其基因頻率在兩鯽群體魚中存在一定的差異，如Tfa在草海鯽魚中的頻率為0.108 7，在普安鯽魚中僅為0.036 2；而Tfb在草海鯽魚中的頻率只有0.021 7，在普安鯽魚中則高達(dá)0.181 2；Tfd在草海鯽魚中的頻率為0.007 2，在普安鯽魚則為0.050 7；Tff在草海鯽魚中的頻率為0.152 2，而在普安鯽魚中僅有0.007 2；同樣Tfh的頻率也在兩群體鯽魚中存在差異。同時(shí)在2個(gè)群體中還存在著各自群體特有的等位基因，普安鯽魚特有Tfi，草海鯽魚特有Tfe、Tfg。

魚類Tf的多態(tài)性與其生活環(huán)境和生活習(xí)性存在一定的相關(guān)性，不同屬種、品種(品系)間由于其生活習(xí)性和生存環(huán)境的不同，血清Tf有很大差異，主要表現(xiàn)為存在各自Tf區(qū)的特定位置，其基因型和基因頻率分布也各不相同[12-13]。因此本研究的結(jié)果表明，在復(fù)雜多變的生存環(huán)境中草海鯽魚較普安鯽魚更具良好的調(diào)控能力。

從本研究3個(gè)群體鯽魚間遺傳距離和相似性指數(shù)以及共享的等位基因結(jié)果來看，草海鯽魚與普安鯽魚相似性最高，與紅鯽相似性次之，而紅鯽與普安鯽魚相似性最低。在鯽屬魚類的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上，紅鯽是一種標(biāo)準(zhǔn)的二倍體鯽魚，在鯽魚中進(jìn)化地位較低，普安鯽魚是一種進(jìn)化地位較高的鯽魚類，屬雌核發(fā)育的三倍體魚類[14]。而有關(guān)草海鯽魚的初步研究表明[15-16]，它是一種由二倍體和三倍體組成的混合群體。本研究結(jié)果表明，草海鯽魚遺傳組成較為復(fù)雜，既與普安鯽魚有相似的地方，也存在不同之處；且草海鯽魚與紅鯽也存在一定的相似性。本研究結(jié)果也從蛋白質(zhì)的水平證明草海鯽魚是一種由二倍體和三倍體組成的混合群體。

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Genetic Diversity Study of Two Groups ofCarassiusauratusinKarst Mountainous Area Based on Transferrin

ZHOU Qichun1,AN Miao2*,WANG Jinna3,GUO Jiankang2,YANG Xing1,LI Jianguang1

(1．Guizhou Fisheries Research Institute,Guiyang 550025,China； 2.College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China； 3.Aquaculture Technology Centre of Zheng’an County,Zheng’an 563400,China)

In order to study the genetic diversity and genetic difference at protein levels of two kinds of crucian carp (Carassiusauratus) in Karst mountainous area,the electrophoresis phenotype of serum transferrin(Tf) and diversity were studied by the method of polyacrylamide gel electrophoresis.The results showed that the groups clonal diversity index showed Caohai crucian carp(0.32)﹥Red crucian carp(0.25)﹥Puan crucian carp(0.13).Thirteen phenotypes of three kinds of crucian carp were determined by nine kinds of different alleles, frequencies of allelic genes wereTfa0.144 9,Tfb0.202 9,Tfc0.036 2,Tfd0.058 0,Tfe0.007 2,Tff0.239 1,Tfg0.014 5,Tfh0.275 4,Tfi0.029 0,respectively.There were none shared genotype among three kinds of crucian carp.They had higher genetic similarity and smaller genetic distances between Puan crucian carp and Caohai crucian carp,which were 0.714 3 and 0.285 7,respectively.Researches demonstrated that clonal diversity was higher and the transferrin diversity level was richer in Caohai crucian carp than in Puan crucian carp.The genetic diversity was more complicated of Caohai crucian carp, and there were lots of similarities with Puan crucian carp, however,there were also differences between them.

Karst mountainous area;Carassiusauratus; transferrin; genetic diversity

2016-06-10

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CARS-46)；貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合NY字(2009)3070]；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目[黔科合J字(2011)2223]

周其椿(1987-)，男，貴州石阡人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事水產(chǎn)動物遺傳育種及種質(zhì)資源研究與應(yīng)用工作。 E-mail:zhou.qichun@163.com

*通訊作者：安 苗(1970-)，男，貴州德江人，副教授，主要從事水產(chǎn)動物增養(yǎng)殖的教學(xué)和魚類種質(zhì)資源研究工作。 E-mail:gzuam@163.com

時(shí)間：2016-11-25 14∶24∶33

Q953

A

1004-3268(2016)12-0143-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.029.html