第三代流式細胞分選儀及96孔板分選單個細胞的方法及參數(shù)優(yōu)化

閔智慧， 程韻楓

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院臨床研究院實驗研究中心，上海 200032 2.復旦大學附屬中山醫(yī)院血液科，上海 200032 3.復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院實驗研究中心，上海 201700 4.復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院血液科，上海 201700 5.上海市器官移植重點實驗室，上海 200032

技術與方法

第三代流式細胞分選儀及96孔板分選單個細胞的方法及參數(shù)優(yōu)化

閔智慧1,3,5， 程韻楓1,2,3,4,5

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院臨床研究院實驗研究中心，上海 200032 2.復旦大學附屬中山醫(yī)院血液科，上海 200032 3.復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院實驗研究中心，上海 201700 4.復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院血液科，上海 201700 5.上海市器官移植重點實驗室，上海 200032

目的：用第三代流式細胞分選儀比較不同直徑噴嘴分選的單細胞的得率及細胞活性，進一步完善單細胞微孔板分選的參數(shù)設置及條件優(yōu)化。方法：用FACSAria Ⅲ 流式細胞分選儀及96孔板對Raji細胞、A549、DT 40、RAW 264.7 細胞系進行單細胞分選，分別采用70 μm 、100 μm 和130 μm噴嘴分選，比較分選后單細胞得率及克隆形成率。結果：在單細胞分選模式下，用3種不同直徑噴嘴及96孔板分選后的單細胞得率為86.55%～93.44%，即96孔板有單細胞的孔數(shù)為84～92孔；分選后的單個細胞培養(yǎng)7 d后，經70 μm 、100 μm 和130 μm噴嘴分選的單細胞克隆孔數(shù)分別為31～52孔、49～70孔、58～78孔。結論：進行單細胞微孔板分選時，在精確調節(jié)及優(yōu)化實驗參數(shù)的前提下，為了保證單細胞的活性，應優(yōu)先選擇100 μm或130 μm噴嘴。

單細胞分選；流式細胞分選儀；96孔板；噴嘴；液滴延遲

隨著分選型流式細胞儀功能的不斷完善，其在單細胞分選相關研究中的應用越來越廣泛，尤其廣泛應用于細胞個體差異研究、單細胞基因測序、轉錄組學研究[1]，以及代謝物轉運途徑、腫瘤細胞免疫應答機制、富集異質性微生物群落研究等方面[2-5]。第3代分選型流式細胞儀FACSAriaⅢ是FACSAria系列最新型的高端分選系統(tǒng)之一，其光學系統(tǒng)具有更高的靈敏度和檢測分辨率，液流系統(tǒng)較前兩代更加穩(wěn)定，且有更好的數(shù)據(jù)獲取和分析功能，這些特點有利于提高分選效率。此外，分選前流式細胞儀參數(shù)、噴嘴尺寸的選擇對于保證高分選效率和高分選純度亦很重要，但這需要豐富的經驗和一定的技巧，且目前相關報道很少。本研究旨在探討應用FACSAriaⅢ及96孔板進行單細胞分選時的主要參數(shù)調節(jié)及不同直徑噴嘴對細胞純度和活性的影響，為單細胞分選相關研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 FACSAriaⅢ分選型流式細胞儀，自動細胞定位分選裝置 (ACDU) 及ACDU制冷循環(huán)裝置、質控微球(貨號：642412)、分選熒光校準微球(貨號：345249)、FACSFlow鞘液20 L(貨號：342003)均購自美國BD 公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)和胰酶均購自美國Gibco公司。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與樣本制備 人Burkitt's 淋巴瘤Raji細胞、人肺腺癌細胞A549、雞淋巴瘤DT 40采用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，小鼠單核巨噬白血病細胞RAW 264.7用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。所有細胞均置于含5% CO2、37℃、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。分選前將對數(shù)生長期的A549和RAW 264.7細胞用胰酶消化，制備成單細胞懸液；將Raji 和DT 40細胞重懸， 300×g離心5 min，再次制備成單細胞懸液。細胞均重懸于無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中(1×106個/mL)，用400目濾網(wǎng)過濾，置于冰上。整個操作過程在超凈臺中完成。

1.2.2 流式細胞儀常規(guī)校準 打開FACSAriaⅢ 儀器總開關及電腦的Diva軟件，聯(lián)機后執(zhí)行開機程序。首先安裝70 μm噴嘴 (nozzle，應用前經超聲洗滌1 min) ，從Diva軟件菜單Sort Setup中選擇對應的噴嘴尺寸，cytometer菜單中選擇相應配置 (Configuration) ，打開主液流窗口 (Stream) ，待液流穩(wěn)定后，調節(jié)液滴的頻率 (Freq) 和振幅 (Ampl)，使液流斷點位于窗口的1/3～2/3處、液滴斷裂間隔數(shù)值 (Gap) 趨于恒定。然后進入儀器質控CS&T程序，根據(jù)流程提示，上樣CS&T質控微球，儀器自動質檢通過表明儀器整體狀態(tài)穩(wěn)定，可開始單細胞分選。70 μm噴嘴單細胞分選完畢后更換成100 μm及130 μm噴嘴，每更換1次噴嘴須重新按照上述步驟調節(jié)儀器。

1.2.3 分選偏轉液流調節(jié) 進行微孔板分選時，需要于分選槽下方插入液滴防濺板，用75%乙醇擦拭電極偏轉板，使其保持清潔、干燥。調好主液流后，點中側液流窗口的電壓 (Voltage) 圖標，使液流帶電，激活測試分選 (Test Sort) 圖標，通過微調振幅和第2滴 斷點(Drop 2)使4路偏轉的液流分束清楚且各自集中。打開Waste Drawer圖標，肉眼觀察帶電液流偏轉情況，通過移動下方的滑動條使左側帶電偏轉的兩束液流 (Left和Far Left) 重合通過防濺孔中心(下方滑動條的數(shù)字一致代表兩束液流重合)，再關閉右側偏轉的兩束液流，調節(jié)完畢后關閉Waste Drawer。在主液流窗口輸入第1滴斷點(Drop 1)和Gap的實際數(shù)值后，選中同窗口的Sweet Spot圖標后，F(xiàn)ACSAriaⅢ自動調節(jié)液滴振幅使Drop 1 位置保持恒定，斷點位置波動在1～10屬于可接受范圍。

1.2.4 液滴延遲調節(jié) 根據(jù)試劑說明書用PBS配制分選熒光校準微球，用于分選時液滴延遲的調節(jié)。先建立調節(jié)液滴延遲的實驗文件，創(chuàng)建新的樣品管及工作模板，在工作界面建立散點圖 (FSC 比 SSC) 和柱狀圖 (FSC histogram)，設Interval門為P1，包括整個柱狀圖，固定FSC閾值為5 000。創(chuàng)建分選窗口(Sort Layout)，在設備 (Device)窗口中選擇2管( Tube)，在分選指標(Target events)選項中選連續(xù)分選(continuous)，分選左路添加 P1門。上樣稀釋好的熒光校準微球，調節(jié)流速為1 000～1 500個/s，打開Auto Delay 軟件儀器以自動調節(jié)液滴延遲并保存數(shù)值。

1.2.5 分選前96孔板精確定位 提前打開ACDU 制冷循環(huán)裝置，溫度設為4℃，預冷。將96孔板置于ACDU上，使A1孔位于左前方。軟件菜單依次選擇分選 (Sort)、主頁設置(Home Device)，出現(xiàn)設備安裝(Device Setup)界面 (圖1)，選擇96孔板，點擊顯示主頁(Go to Home)，96孔板自動移動到默認分選開始位置，再點開該界面的測試液滴圖標，系統(tǒng)自動加電，左邊產生一束偏轉液流通過防濺孔中心落入96孔板的板蓋上。如果液流沒有落在A1孔中心位置，可點擊界面中的雙箭頭和單箭頭對孔板位置進行粗調和微調。調好后，點擊固定主頁 (Set Home)，保存即可。為了分選的精確定位，還需要預分選細胞到孔板蓋上，觀察液滴位置。取500 μL準備好的樣本于流式管中，上樣，建立散點圖 (FSC比 SSC)，并設好P1門，在Sort Layout的Device菜單中選96孔板 (96-Well Plate)，精度 (Precision)菜單中選單細胞 (Single Cell)，分選 A～C前三橫排，每排分P1門的10個細胞，點擊Sort，開始分選。分好后，取出96孔板，觀察蓋子上小液滴是否位于每個孔的中心，如果有偏移還應進入Device Setup界面進行微調。

圖1 ACDU精確定位界面

1.2.6 96孔板單細胞分選 提前打開上樣倉4℃預冷，取下96孔板的蓋子，96孔板每孔預先加入100 μL培養(yǎng)液。新建實驗文件，建立散點圖 (FSC比 SSC)，設P1門選定A549或Raji細胞；對于Raw 264.7細胞和DT 40細胞，再設P2門選定GFP陽性細胞。分別加入用300目無菌尼龍篩網(wǎng)過濾后的不同種類的細胞，在Sort Layout依次設每孔分選P1或P2門內的1個細胞，開始分選，每種細胞依次用70 μm 、100 μm及130 μm噴嘴分別分選3塊96孔板。分選結束后，立刻加蓋并取出96孔板，倒置顯微鏡下觀察計數(shù)分選后的單細胞孔數(shù)，再置于細胞培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)7 d后計數(shù)有單細胞克隆的孔數(shù)。

2 結 果

2.1 3種不同直徑噴嘴液流調試結果 依次安裝70 μm 、100 μm 和130 μm 噴嘴后，調試好的主液流見圖2A～2C。主液流斷點及Gap灰?guī)挥诖翱诘?/3～2/3處，每個主液滴近似圓形，衛(wèi)星點逐漸融入主液滴。液流加電壓后，側液流窗口可見清晰集中的直徑約2 mm左右的斑點，中央流入廢液槽的斑點直徑約4 mm。如果斑點不夠明亮，可調節(jié)攝像頭的螺釘旋鈕，至液流光斑最亮。調節(jié)滑動條將 Far Left 和 Left 兩束液流重合使其通過防濺孔中心 (圖2D)。

2.2 3種不同直徑噴嘴液滴延遲調試結果 液滴延遲時間為從激光分析檢測點到液流充電斷裂成液滴的時間。液滴延遲需要調節(jié)，F(xiàn)ACSAria Ⅲ具備自動調試液滴延遲的功能。不同直徑的噴嘴液滴延遲數(shù)值不同，本實驗中，經軟件自動調節(jié)的70 μm、100 μm、130 μm噴嘴的液滴延遲值分別為42.31、30.60、18.68，左框的液滴比例達99%～100%(圖2E～2G)，說明分選精確性較高。

圖2 3種噴嘴液流斷點、偏轉液流通過防濺孔中心及液滴延遲調節(jié)結果

A、B、C：液滴通過70 μm、100 μm、130 μm噴嘴；D：偏轉液流通過防濺孔中心(箭頭所示為防濺孔中心)；E、F、G：液滴通過70 μm、100 μm、130 μm噴嘴的延遲值

2.3 分選前96孔板精確定位結果 調節(jié)偏轉液流使其落到96孔板A1孔中心位置后，進行預分選至板蓋，進一步觀察分選液滴實際下落的位置。結果顯示，由10個細胞組成的液滴分選至前3排板蓋每孔中心點，且在光線下清晰可見，分選時微孔板的位置未發(fā)生偏移。

2.4 不同直徑噴嘴對用96孔板分選的單細胞純度及活性的影響 在96孔板Single Cell分選模式下，70 μm噴嘴分選的Raji、A549、Raw 264.7、DT 40單細胞孔數(shù)為84～90，所占百分比(即單細胞得率)分別為(92.36±2.19)%、(87.84±0.33)%、(90.63±1.73)%、(88.89±0.86)%；100 μm噴嘴分選的上述4種細胞的單細胞孔數(shù)為85～92，所占百分比分別為(93.44±1.02)%、(89.54±1.51)%、(90.06±1.85)%、(87.82±0.38)%；130 μm噴嘴分選的上述4種細胞的單細胞孔數(shù)為86～90，所占百分比分別為(89.75±0.87)%、(90.25±1.33)%、(90.84±1.59)%、(86.55±1.47)%。分選后的單個細胞培養(yǎng)7 d后，用70 μm噴嘴分選的單細胞克隆形成的孔數(shù)為31～52孔；用100 μm噴嘴分選的單細胞克隆形成的孔數(shù)為49～70孔，用130 μm噴嘴分選的單細胞形成克隆的孔數(shù)為58～78孔。倒置顯微鏡下觀察，見細胞折光性好；培養(yǎng)7 d后，可見數(shù)十個細胞分裂形成克隆，Raw 264.7和DT40由于轉染有GFP載體而呈綠色熒光(圖3)。

圖3 3種噴嘴96孔板分選的4種單細胞的培養(yǎng)結果Original magnification: ×200

3 討 論

單細胞分選技術有助于觀察細胞狀態(tài)，研究基因表達及調控，進而分析疾病病理進展的本質。目前，流式細胞儀分選是獲取單個細胞的最佳方法。該方法具有高通量、多參數(shù)、耗時短、無污染等優(yōu)勢，而且分選后的細胞能直接培養(yǎng)、移植，用于提取核酸、單細胞PCR擴增或原位雜交等，以及進行細胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同細胞的差異化研究[6-9]。

流式細胞儀分選時，樣本流在鞘液的包裹和流體動力學的推動下，以一定速度聚焦并從流動室的噴嘴噴出。由于噴嘴處有超高頻的壓電晶體，能產生高頻振蕩，當加電壓后噴出的液流被振蕩斷裂成均勻的微小液滴，待分選的細胞即分散在這些液滴中。通過設置，待分選的細胞可被充以正、負電荷，當流經電壓偏轉板時，在電場的作用下發(fā)生偏轉落入收集管或微孔板中，沒有充電的液滴落入中間的廢液槽，從而實現(xiàn)細胞的分選。進行微孔板分選需要在Single Cell模式下，調節(jié)Far Left液流的偏轉使其通過防濺孔中心。Single Cell分選模式較Purity或Yield模式對液流調試的精確度要求更高，尤其是對分選前96孔板A1 孔的精確定位，如果液滴沒有落在A1孔的中心位置，將會影響后續(xù)分選的準確性，細胞容易發(fā)生偏移甚至落在孔板的間隙。因此穩(wěn)妥的方法是除了要微調偏轉液流使其通過防濺孔中心落到96孔板A1孔中心位置，還要進行預分選細胞到96孔板蓋上前3～5排，每孔10個細胞，分好后再肉眼觀察10個細胞形成的可見小液滴落入孔的實際位置，再據(jù)此進行微調使液滴落入孔中心。只要觀察到大多數(shù)液滴落入前3～5排孔的中心位置，就能保證整塊微孔板分選時的準確位置。在96孔板分選時，理論上可以獲得100%的單細胞分選得率，而實際上儀器運行中樣本流、鞘液流細微的波動以及ACDU裝置移動時的輕微慣性等因素都可能導致個別細胞發(fā)生偏移而無法落入孔內，使單細胞分選得率一定程度降低。

本研究選用常用的3種不同直徑的噴嘴對4種細胞系進行96孔板單細胞分選，觀察分選后單細胞得率及細胞活性，結果表明，3種細胞系經3種噴嘴分選后的單細胞得率均無明顯差異，單細胞得率在86%以上，說明3種噴嘴都能實現(xiàn)良好的單細胞分選得率。但是培養(yǎng)7 d后，結果顯示，用70 μm噴嘴分選的單細胞的克隆形成孔數(shù)為31～52孔，130 μm噴嘴分選的單細胞的克隆形成孔數(shù)最多78孔，而100 μm噴嘴分選的單細胞的克隆形成孔數(shù)介于兩者之間，為49～70孔，表明噴嘴直徑越大，分選的細胞活性越好，單細胞形成的克隆孔數(shù)也越多。這與不同直徑的噴嘴液流壓力不同有關，130 μm噴嘴管路中液流壓力為10 psi，100 μm噴嘴液流壓力為20 psi，70 μm噴嘴液流壓力最高，為70 psi。流式細胞儀鞘液和樣本流的高速流動都是由壓力驅動的，直徑小的噴嘴對應的流速和振蕩頻率較大，形成的包裹細胞的液滴小而多，分選速度隨之增加，但分選后的細胞活性降低，體積偏大且脆弱的細胞經小噴嘴分選后甚至形成細胞碎片；而直徑大的噴嘴形成的包裹液滴較大，能給細胞較多的緩沖保護作用，另外直徑大的噴嘴分選時鞘液壓力更低，樣本細胞所承受的壓力也更小，分選后的細胞活性相應增高。選擇噴嘴尺寸時還要根據(jù)細胞大小來決定，噴嘴直徑一般大于細胞的5倍才會得到最佳單細胞得率及活性。例如，Raji淋巴瘤細胞直徑約15 μm，可選擇100 μm或130 μm噴嘴進行分選。此外，雖然選擇130 μm噴嘴可得到較高的細胞活性，但這種大尺寸噴嘴更適合分選體積較大的原代細胞等，而且其調試也需要花費更長時間，而100 μm噴嘴足以適用于與淋巴瘤細胞近似大小的多種細胞的分選。除儀器因素外，細胞樣本的制備對分選結果也起決定性的作用，合格的細胞樣本應為：單個細胞懸浮、細胞碎片較少、細胞生長活力良好。本實驗選用的細胞為新復蘇，處于對數(shù)生長期，活性好，因此單細胞克隆形成率也較高。單細胞分選時，細胞懸液的細胞密度不能太高，每秒通過噴嘴500～3 000個細胞可得到較好的分選得率，這可能與細胞密度越小，液流的穩(wěn)定性越好、單位時間內通過激光檢測區(qū)的細胞數(shù)越少有關，從而提高細胞檢測的靈敏度，進而提高分選效率和純度。此外，我們應用ACDU制冷循環(huán)裝置，使分選時的溫度維持在4℃，保證細胞活力；實驗用的鞘液也是儀器專配的20 L無菌PBS，背景噪點低，對分選的干擾較小。

綜上所述，合適的噴嘴大小、精確的液滴延遲、穩(wěn)定的液流、適中的細胞密度及良好的細胞狀態(tài)是保證單細胞分選純度及活性的關鍵，只有平衡上述因素才能得到最佳的分選效果。100μm噴嘴適用于細胞直徑在20 μm以下的單細胞分選；130 μm噴嘴更適用于體積偏大的原代細胞等的單細胞分選；而70 μm噴嘴雖然也有較高的單細胞分選率，但其鞘液壓力偏高使分選后的單個細胞活性降低。因此，應盡量用大噴嘴低壓力進行單細胞分選。該實驗為應用流式細胞儀及微孔板進行單細胞分選的流程及參數(shù)選擇提供了一定的參考，有助于單細胞分選技術的更好應用及后序基因測序等實驗的進行。

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[本文編輯] 姬靜芳

Method and parameter optimization of the third-generation flow cytometry sorter and 96-well plate in single cell sorting

MIN Zhi-hui1,3,5, CHENG Yun-feng1,2,3,4,5

1.Experimental Research Center of Institute for Clinical Sciences, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shangha 200032, China 2.Department of Hematology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 3.Experimental Research Center, Qingpu Branch of Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201700, China 4.Department of Hematology, Qingpu Branch of Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201700, China 5.Shanghai Key Laboratory of Organ Transplantation, Shanghai 200032, China

Objective：To compare the sorted single cell rate and cell viability with different diameters of nozzles by the third-generation flow cytometry sorter FACS Aria Ⅲ so as to further improve the optimization of parameter settings and conditions for single-cell microplate sorting.Methods：Single-cell sorting of four different types of cell lines-Raji cells, A549, DT40, RAW 264.7 cell line-was done on FACSAria Ⅲ flow cytometry sorter and 96-well microplate.70 μm, 100 μm and 130 μm diameter nozzles were adopted respectively, and the sorted single cell rate and the cell colony-forming rate were counted.Results：In the single-cell sorting mode, the percentages of sorted single cell with three nozzles were from 86.55% to 93.44%, which meant that the hole numbers with single cell in the 96-well micorplate were from 84 to 92.After 7-day culture, Single cell clone hole numbers sorted by 70 μm, 100 μm and 130 μm diameter nozzles were 31-52, 49-70 and 58-78, respectively.Conclusions：In single cell sorting with the microplate and under the premise of accurate adjustment and optimization of parameters, 100 μm or 130 μm nozzles should be given preference for single cell activity.

single-cell sorting; flow cytometry sorter; 96-well microplate; nozzle; drop delay

2016-01-14[接受日期]2016-10-15

國家自然科學基金(81170473).Supported by National Natural Science Foundation of China (81170473).

閔智慧, 碩士,工程師.E-mail: min.zhihui@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20151012

Q 2-33

A