多發(fā)性硬化患者外周血S100A8/A9、TLR4和MMP-2表達(dá)水平的變化

劉大進(jìn), 吳明鳳, 余 浩, 張振中, 馬 麗, 姚瑞芹

徐州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，徐州 221004

短篇論著

多發(fā)性硬化患者外周血S100A8/A9、TLR4和MMP-2表達(dá)水平的變化

劉大進(jìn), 吳明鳳, 余 浩, 張振中, 馬 麗, 姚瑞芹*

徐州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，徐州 221004

目的：探討多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)患者外周靜脈血血清鈣結(jié)合蛋白復(fù)合物(S100A8/A9)、Toll-樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)和基質(zhì)金屬酶蛋白2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)表達(dá)水平的變化。方法：選取MS患者16例作為MS組，健康體檢者16例作為對(duì)照組。采用蛋白芯片檢測(cè)法對(duì)血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，定量分析血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2表達(dá)水平的變化。結(jié)果：MS組血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平均高于對(duì)照組(P<0.01)；MS組患者血清中上述3個(gè)指標(biāo)具有明顯相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論：MS患者血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2表達(dá)上調(diào)，聯(lián)合檢測(cè)三者可能有助于臨床MS疾病活動(dòng)狀態(tài)的判斷。

多發(fā)性硬化；S100A8/A9；TLR4；MMP-2

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)脫髓鞘性疾病，其發(fā)病與多種因素有關(guān)，其中自身免疫性炎癥反應(yīng)在MS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。研究表明，鈣結(jié)合蛋白復(fù)合物(S100A8/A9)參與了神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的起始過(guò)程[1]，并且在多種急慢性炎癥性疾病[2]和腫瘤疾病[3]中發(fā)揮重要作用。S100A8/A9不僅可作為Toll-樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)的內(nèi)源性配體與其結(jié)合，促進(jìn)IL-17的表達(dá)并激活CD8+T細(xì)胞，從而誘發(fā)自身免疫反應(yīng)[4]，而且可以通過(guò)激活基質(zhì)金屬酶蛋白2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)介導(dǎo)組織損傷[5]。TLR4的激活可以直接通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)其下游靶蛋白MMP-2的表達(dá)和激活[6-7]，發(fā)揮生物學(xué)功能。因此，上述三者功能上的緊密聯(lián)系與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MS作為典型的神經(jīng)系統(tǒng)免疫性損傷疾病，其發(fā)病過(guò)程中上述3個(gè)指標(biāo)可能呈現(xiàn)規(guī)律性改變，但目前鮮見(jiàn)關(guān)于S100A8/A9、TLR4和MMP-2在MS病程中的變化報(bào)道。因此，本研究檢測(cè)了上述指標(biāo)在MS患者血清中的表達(dá)變化，旨在探討三者與MS的關(guān)系，為MS的臨床診斷、治療及預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月至2015年6月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院住院的MS確診患者16例為MS組，其中男性4例，女性12例；年齡25～50歲，平均(40.13±9.00)歲。全部MS患者均符合2010年McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前3個(gè)月內(nèi)接受免疫調(diào)節(jié)治療的患者；合并其他免疫相關(guān)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、腫瘤等患者；合并顱內(nèi)外感染，如腦炎、腦膜炎等患者；腦卒中患者。

對(duì)照組為本院健康體檢者16例，其中男性4例，女性12例；年齡25～48歲，平均(38.88±6.92)歲，無(wú)心肝腎等器質(zhì)性疾病史，采血前1周無(wú)服藥史，自愿參與研究。兩組人群年齡、性別構(gòu)成、病程和受教育年限差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，具有可比性。

組別n年齡(歲)性別(男/女)病程(年)受教育年限(年)MS組1640．13±9．004/125．75±2．3210．13±2．64對(duì)照組1638．88±6．924/12-10．50±3．67P值1．0000．6351．000-0．872

1.2 檢測(cè)方法 采用RayBio○RG-系列玻片式人細(xì)胞因子抗體芯片(蛋白芯片)對(duì)血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)激光掃描儀檢測(cè)熒光信號(hào)，定量分析血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平。所有患者均簽署知情同意書(shū)后，MS組于上午采血，正常對(duì)照組于清晨空腹抽血，采肘靜脈血5 mL，立即1 500×g離心5 min，取上清分裝于分離管內(nèi)，標(biāo)記，-80℃凍存待測(cè)。蛋白芯片檢測(cè)由廣州瑞博奧生物科技有限公司完成。

2 結(jié) 果

各組患者血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平熒光定量分析結(jié)果顯示，MS組血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平均高于對(duì)照組(圖1)。

圖1 2組患者血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平的比較**P<0.01, ***P<0.001與對(duì)照組相比

MS組患者血清S100A8/A9、TLR4及MMP-2相關(guān)性分析顯示，在去除個(gè)別離群值后，3者之間兩兩相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 MS組血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

3 討 論

MS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣，目前對(duì)于MS疾病的診斷主要是依據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合腦脊液、神經(jīng)電生理學(xué)和影像學(xué)檢查。血清學(xué)檢查在目前的臨床診斷中應(yīng)用極少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)患者血清中S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平變化發(fā)現(xiàn)，三者在MS患者血清中的含量比正常對(duì)照組明顯升高，提示血清學(xué)相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)在臨床MS患者診斷中可能也具有一定的輔助價(jià)值。對(duì)于傳統(tǒng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)難以評(píng)價(jià)和確診的MS，應(yīng)用血清學(xué)檢查有望成為重要的診斷依據(jù)，實(shí)現(xiàn)早期診斷和及時(shí)治療。

自身免疫性炎癥反應(yīng)在MS的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。免疫系統(tǒng)的活化與炎癥因子的釋放是介導(dǎo)自身免疫病的基礎(chǔ)。S100鈣調(diào)素蛋白家族中的重要成員S100A8和S100A9構(gòu)成的異源二聚體S100A8/A9參與炎癥反應(yīng)，與機(jī)體自身免疫病關(guān)系密切。其主要存在于炎性細(xì)胞的胞質(zhì)中或胞膜上，在炎癥狀態(tài)下，炎性細(xì)胞活化后被釋放入血漿及體液，因而被認(rèn)為是一種潛在的臨床炎癥標(biāo)記物。S100A8/A9已被證實(shí)在多種炎癥狀態(tài)下高表達(dá)，如巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、囊性纖維病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤及自身免疫性疾病[9-10]。但其在臨床MS病程中的具體變化目前未見(jiàn)報(bào)道。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，在自身免疫病患者疾病發(fā)作前，尚無(wú)任何其他臨床標(biāo)記可提示時(shí)，S100A8/A9已開(kāi)始升高。本研究中MS組患者血清S100A8/A9水平較正常對(duì)照組顯著升高，S100A8/A9在MS組血清中含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組(約10倍)，進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。且van Bon等[11]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在另一種自身免疫性疾病系統(tǒng)性硬化患者的血清中，S100A8/A9水平明顯上調(diào)。提示S100A8/A9對(duì)于自身免疫性疾病如MS的診斷和治療具有一定的意義。

TLR4是天然免疫系統(tǒng)識(shí)別病原微生物的主要受體，通過(guò)與微生物病原相關(guān)分子模式相結(jié)合，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在人體天然免疫及獲得性免疫中起重要作用。TLR4分布廣泛，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種細(xì)胞中均有表達(dá)，如小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等[12]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)TLR4炎性反應(yīng)的主要細(xì)胞類型，較易被激活誘導(dǎo)。TLR4主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞。在MS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變周圍除有T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)外，還有大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，這提示TLR4參與介導(dǎo)了神經(jīng)元損傷[13]。Olson等[14]報(bào)道，TLR4在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)水平在整個(gè)疾病過(guò)程中始終呈持續(xù)升高狀態(tài)。而抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[15]對(duì)EAE發(fā)生具有一定抑制作用[16]。本研究結(jié)果顯示，MS組患者血清樣本中TLR4含量明顯高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TLR4在人類MS疾病進(jìn)程中與EAE動(dòng)物模型中發(fā)揮相似的作用，促進(jìn)MS發(fā)病。

MMPs是一類能特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶家族，與炎癥、感染及自身免疫疾病密切相關(guān)。MMP-2作為該家族最主要成員之一，在炎癥細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)中被廣泛研究[7]。MMP-2在CNS疾病血腦屏障的破壞中發(fā)揮重要的作用[17]。研究[18]表明，在EAE大鼠模型中，MMP-2在疾病早期即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，當(dāng)MMP-2分泌過(guò)量時(shí)可以降解血管的基底膜，引起血腦屏障開(kāi)放，促進(jìn)炎性細(xì)胞向CNS浸潤(rùn)最終導(dǎo)致軸突損傷。向EAE大鼠大腦內(nèi)注射MMP-2可以導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的破壞和血腦屏障的開(kāi)放，加速EAE的發(fā)病[19]。而在EAE模型中應(yīng)用具有抑制MMPs活性的二甲胺四環(huán)素(minocycline)可以減輕動(dòng)物的發(fā)病程度[17]。本研究結(jié)果顯示，在MS患者血清樣本中MMP-2的含量顯著高于正常對(duì)照組，這與之前的報(bào)道結(jié)果一致。說(shuō)明對(duì)MMP-2進(jìn)行干預(yù)可能在MS的診斷和治療中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

綜上，S100A8/A9、TLR4和MMP-2在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著廣泛的作用。三者既可能是獨(dú)立作用于機(jī)體引起疾病，也可能是通過(guò)某種內(nèi)在聯(lián)系共同作用于機(jī)體導(dǎo)致發(fā)病。從相關(guān)性分析結(jié)果來(lái)看，三者在MS患者血清中的表達(dá)水平存在明顯的相關(guān)性，因此，我們推測(cè)S100A8/A9、TLR4和MMP-2在MS疾病的發(fā)展中很可能是相互作用、相互關(guān)聯(lián)的。三者在MS病程中的可能作用機(jī)制為：(1)活化的炎癥細(xì)胞釋放S100A8/A9異二聚體至細(xì)胞外，與TLR4結(jié)合后經(jīng)過(guò)MyD88依賴通路或MyD88非依賴通路激活NF-κB和p38 MAPK信號(hào)通道促進(jìn)炎癥因子的合成與釋放，并放大炎癥因子反應(yīng)，誘導(dǎo)MS發(fā)病。(2)S100A8/A9通過(guò)結(jié)合TLR4促進(jìn)MMP-2的表達(dá)，介導(dǎo)血腦屏障的破壞，促進(jìn)炎性細(xì)胞和炎癥介質(zhì)向CNS浸潤(rùn)，加速M(fèi)S發(fā)病。(3)S100A8/A9直接激活或通過(guò)TLR4介導(dǎo)的NF-κB通路激活MMP-2，直接介導(dǎo)軸索損傷。

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[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

Changes of serum S100A8/A9, TLR4, and MMP-2 levels in multiple sclerosis patients

LIU Da-jin, WU Ming-feng, YU Hao, ZHANG Zhen-zhong, MA Li, YAO Rui-qin*

Research Center of Neurobiology, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu, China

Objective：To investigate the clinical significance of S100A8/A9, Toll-like receptor 4 (TLR4) and matrix metalloproteinase (MMP-2) levels in peripheral venous serum of patients with multiple sclerosis (MS).Methods：Totally 16 cases of MS patients were selected as MS group, and 16 cases of healthy people as control group.The serum samples were detected by protein chip detection method to quantificationally analyze the changes of serum S100A8/A9, TLR4 and MMP-2 levels.Results：The serum of S100A8/A9, TLR4 and MMP-2 levels in MS group were significantly higher than which in control group (P<0.01); The three indicators in MS patients showed significant correlations (P<0.05).Conclusions：The expression of S100A8/A9, TLR4 and MMP-2 in the serum of patients with clinical MS is up-regulated, suggesting that they might be involved in the pathogenesis of MS.Combined detection of serum S100A8/A9, TLR4 and MMP-2 levels may provide a new way of thinking for the diagnosis, treatment and judgment of state in clinical MS.

multiple sclerosis; S100A8/A9; TLR4; MMP-2

2016-08-21[接受日期]2016-09-05

國(guó)家自然科學(xué)基金(81271345)，江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131132)，江蘇省2014年度高?！扒嗨{(lán)工程”中青年學(xué)術(shù)帶頭人資助項(xiàng)目，江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目(15KJB180018，15KJB310023).Supported by National Natural Science Foundation of China (81271345), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20131132), and 2014 "Qing Lan Project" Young Academic Leaders Foundation Project in Colleges and Universities of Jiangsu Province, Surface Project of University Natural Science Research of Jiangsu Province(15KJB180018,15KJB310023).

劉大進(jìn)，碩士生.E-mail: LDJ_XZMU@163.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0516-83262301, E-mail: wenxi_yao@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160830

R 744.5+1

A