原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌中核不均一核糖核蛋白A1的定位及臨床意義

周正君， 王曉怡， 陳二寶， 胡志強(qiáng)， 周少來， 周 儉,2， 樊 嘉,2， 代 智*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032 2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032

論 著

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌中核不均一核糖核蛋白A1的定位及臨床意義

周正君1， 王曉怡1， 陳二寶1， 胡志強(qiáng)1， 周少來1， 周 儉1,2， 樊 嘉1,2， 代 智1*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032 2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032

目的：觀察核不均一核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, hnRNP A1) 在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(肝癌)中的定位，初步分析該蛋白定位與肝癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性及其預(yù)測(cè)患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值。方法：由323例肝癌患者肝癌組織構(gòu)成組織芯片集，采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，觀察肝組織中hnRNP A1的定位，分析hnRNP A1定位與臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果：hnRNP A1蛋白在正常肝細(xì)胞核中表達(dá)呈弱陽性，在肝癌組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有不同程度的陽性表達(dá)。hnRNP A1在肝癌細(xì)胞質(zhì)中定位的肝癌患者的術(shù)后預(yù)后最差。結(jié)論：hnRNP A1蛋白是較好的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，其能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肝癌患者術(shù)后的預(yù)后。

核不均一核糖核蛋白A1；肝癌；預(yù)后

核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs)家族是一組核內(nèi)RNA結(jié)合蛋白，廣泛參與調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄、外顯子剪接、pre-mRNA的成熟和降解以及DNA復(fù)制和重組等生物學(xué)過程[1]。hnRNPs家族蛋白與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。該家族蛋白成員的異常定位與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)。早期研究[2-5]證實(shí)，hnRNP A2/B1可作為肺癌臨床早期診斷的參考指標(biāo)。

核不均一核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, hnRNP A1)是近年來研究較多的hnRNP A/B亞家族成員之一。其在RNA調(diào)節(jié)、端粒延長、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮重要作用，這為進(jìn)一步完善腫瘤的診斷、治療以及預(yù)防提供了新的理論依據(jù)[6-9]。但其在肝細(xì)胞肝癌中的定位及臨床意義研究在國內(nèi)外報(bào)道較少。因此，本研究旨在觀察hnRNP A1在肝細(xì)胞肝癌組織中的定位，初步分析hnRNP A1蛋白定位與肝癌臨床病理之間的相關(guān)性，探討其定位在預(yù)測(cè)患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科2003年1月至2004年3月接受的首次進(jìn)行根治性腫瘤切除并經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌的323例患者?；颊咝g(shù)前均未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時(shí)未接受過放、化療，手術(shù)切除等抗腫瘤治療。患者臨床病理資料見表1。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。所有患者知情同意并簽署知情同意書。所有患者手術(shù)標(biāo)本均在術(shù)后15 min內(nèi)采集并立即放入液氮中，于-80℃冰箱保存。

1.2 組織芯片制備 使用直徑1.0 mm的組織穿刺針取出石蠟標(biāo)本的組織芯，有規(guī)律地排列在空白蠟塊上制備成組織陣列塊；將組織陣列塊在52℃恒溫烤箱中加熱融合，使組織芯與蠟塊緊密相連；對(duì)組織陣列塊進(jìn)行修整，至80%的組織芯曝露；對(duì)組織陣列塊按4 μm進(jìn)行常規(guī)切片，裱于經(jīng)10%多聚賴氨酸處理的載玻片上，制成組織芯片。將組織芯片按編號(hào)每隔10張抽取1張作H-E染色，鏡檢判斷組織芯片上的樣本點(diǎn)完整程度。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)SP法，參照SP免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行。hnRNP A1單克隆抗體由Abcam公司提供。載玻片經(jīng)0.3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶、微波抗原修復(fù)、5%羊血清封閉后，加按1∶2 000 稀釋的hnRNP A1單抗，4℃過夜，再加入二抗，37℃孵育30 min，DAB 顯色。其中1張以PBS 代替一抗作為對(duì)照，其余步驟不變。結(jié)果判斷：先后由2名病理科醫(yī)師采用雙盲法觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。累積生存時(shí)間和累積生存率的計(jì)算采用Kaplan-Meier 法；生存檢驗(yàn)采用Log-rank檢驗(yàn)。單因素和多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型(將單因素分析中P<0.05的變量納入模型)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

表1 患者臨床資料

AFP: 甲胎蛋白；GGT：谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；HCV：丙型肝炎病毒；HBsAg：乙型肝炎表面抗原

2 結(jié) 果

2.1 hnRNP A1在肝細(xì)胞肝癌組織中的定位 免疫組織化學(xué)結(jié)果(圖1)表明：hnRNP A1蛋白在正常肝細(xì)胞核中呈弱陽性表達(dá)；在肝細(xì)胞肝癌組織細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均呈強(qiáng)陽性表達(dá)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，光鏡下hnRNP A1表達(dá)陽性產(chǎn)物呈棕黃色，呈核型分布、質(zhì)型分布和核質(zhì)分布。參考免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，將323例標(biāo)本依據(jù)hnRNP A1定位分布，分成以下3組，核型分布：hnRNP A1蛋白在核中表達(dá)(89例)，核質(zhì)分布：hnRNP A1蛋白在核和胞質(zhì)中均表達(dá)(113例),質(zhì)型分布：hnRNP A1蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(121例)。

圖1 hnRNP A1在肝組織中的定位

A、B: hnRNPA1在正常肝組織的分布(original magnification: ×100)；C、D、E: hnRNPA1在肝癌組織中的分布，依次為核型分布、核質(zhì)分布和質(zhì)型分布 (original magnification: ×100)

2.2 hnRNP A1定位與肝細(xì)胞肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系 結(jié)果(表2)表明：不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、血管侵犯、腫瘤包膜和TMN分期患者的hnRNP A1定位差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 hnRNP A1定位與肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后的關(guān)系 結(jié)果(圖2)表明：3組肝癌患者預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中hnRNP A1蛋白質(zhì)型分布患者預(yù)后最差。核型分布患者1年、3年、5年的累積復(fù)發(fā)率和總體生存率分別為17%、91%、35%和75%、43%、67%，質(zhì)型分布患者1年、3年、5年的累積復(fù)發(fā)率和總體生存率分別為20%、82%、60%和52%、75%、38%，兩組患者的預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)果顯示，肝細(xì)胞肝癌組織中hnRNP A1定位異?？赡芘c肝癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.4 生存統(tǒng)計(jì)分析 單因素分析(表3)表明：不同性別、腫瘤大小、血管侵犯、腫瘤包膜、TNM分期患者的累積復(fù)發(fā)率及總體生存率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同AFP水平、 GGT水平、腫瘤數(shù)目和腫瘤分化的患者總體生存率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Cox回歸多因素分析(表4)表明：不同hnRNP A1蛋白定位患者術(shù)后累積復(fù)發(fā)率和總體生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3 討 論

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率是影響患者術(shù)后預(yù)后的兩個(gè)主要因素[10]。深入研究轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程潛在的分子機(jī)制，有助于了解肝癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)行為，從而指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療。hnRNP A1是一種腫瘤相關(guān)抗原，但有關(guān)hnRNP A1與肝癌進(jìn)展的研究尚處于起步階段，有待深入探索。

表2 hnRNP A1表達(dá)定位與肝細(xì)胞肝癌臨床病理特征的關(guān)系

AFP: 甲胎蛋白；GGT：谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶；HCV：丙型肝炎病毒；HBsAg：乙型肝炎表面抗原

圖2 hnRNP A1在肝細(xì)胞肝癌組織中的定位與患者預(yù)后的相關(guān)性A：hnRNP A1定位與患者總體生存率的關(guān)系；B：hnRNP A1定位與患者累積復(fù)發(fā)率的關(guān)系

表3 單因素分析結(jié)果

表4 多因素分析結(jié)果

hnRNP A1作為一種核內(nèi)RNA結(jié)合蛋白，是hnRNP家族的核心成員，參與RNA代謝轉(zhuǎn)錄、mRNA前體的剪接和加工、mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控、核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯等過程[1-5]。以往研究[1]表明，hnRNP A1蛋白可以自由穿梭在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間，與前體mRNA形成復(fù)合體，協(xié)助前體mRNA通過核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并與其他蛋白如RNA多聚酶Ⅱ等一起完成對(duì)前體mRNA的剪接加工及修飾。hnRNP A1蛋白參與核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白翻譯等過程，這些過程隨hnRNPA1蛋白定位的改變而改變[1]。Ma等[11-13]發(fā)現(xiàn)，hnRNP A1的定位在原發(fā)腸癌和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)腸癌患者中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而hnRNP A1在肝細(xì)胞肝癌組織中的定位及其潛在臨床意義目前國內(nèi)外鮮有報(bào)道。因此，hnRNP A1蛋白定位變化是否為腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素及其預(yù)測(cè)患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價(jià)值亟待深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，hnRNP A1蛋白在肝細(xì)胞肝癌組織中的分布形式有核型、質(zhì)型、核質(zhì)型3種；而在正常肝組織中hnRNP A1主要在細(xì)胞核里表達(dá)。本研究在大通量肝癌組織標(biāo)本組成的組織芯片中，發(fā)現(xiàn)肝癌患者以hnRNP A1質(zhì)型分布居多，其中質(zhì)型分布患者有121例，占總?cè)藬?shù)的37.5%，核質(zhì)型和核型分布的患者分別占35.0%、27.5%。結(jié)果表明，在323例肝細(xì)胞肝癌患者中，hnRNP A1質(zhì)型分布患者的預(yù)后最差，與其他兩種分布形式患者的預(yù)后有顯著差異(P<0.001)。

以上研究結(jié)果提示：肝細(xì)胞肝癌組織中hnRNP A1蛋白的異常定位與肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)。其中，hnRNP A1在細(xì)胞質(zhì)中定位可能是肝癌的惡性表型之一。我們已有的研究結(jié)果[14]表明，hnRNP A1蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的重要功能之一是參與調(diào)控CD44ν6剪接體的生成，提示其在肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用。因此，hnRNP A1有望作為預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的參考指標(biāo)之一，深入研究其分子機(jī)制可指導(dǎo)肝癌患者術(shù)后個(gè)體化治療。

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[本文編輯] 葉 婷， 曉 璐

The location and significance of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1in hepatocellular carcinoma

ZHOU Zheng-jun1, WANG Xiao-yi1, CHEN Er-bao1, HU Zhi-qiang1, ZHOU Shao-lai1, ZHOU Jian1,2, FAN Jia1,2, DAI Zhi1*

1.Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2.Institute of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective：To investigate the location of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1(hnRNP A1), and to analyze the relationship between the location and clinicopathologic feature and its prognostic significance in hepatocellular carcinoma (HCC).Methods：The location of hnRNP A1was studied in an independent cohort of 323 HCC patients by immunohistochemistry, the hnRNP A1location and clinicopathologic feature and its prognostic significance in HCC were concluded.Results：For hnRNP A1, there was weak-to-moderate intensity immunoreactivity with nuclear expression in normal liver, while showed cytoplasmic and nuclear loaction in HCC.The cytoplasmic loaction of hnRNP A1is significantly correlated with poor prognosis of HCC patients after operation.Conclusions：The hnRNP A1is a great independent prognostic indicator, which can accurately predict the poor outcome of HCC patients after surgery.

heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1; hepatocellular carcinoma; prognosis

2016-10-28[接受日期]2016-12-16

國家自然科學(xué)基金青年基金(81401926，81502485).Supported by National Natural Science Youth Foundation of China (81401926, 81502485).

周正君，博士，助理研究員.E-mail: zhou.zhengjun@zs-hospital.sh.cn

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-64041990, E-mail: dai.zhi@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160996

R 735.7

A