軟骨組織工程種子細胞源的研究進展

叢 波　綜述　張仲文　審校

?

軟骨組織工程種子細胞源的研究進展

叢 波綜述張仲文審校

【摘要】關(guān)節(jié)軟骨缺損的發(fā)病率較高，患者生活質(zhì)量受到嚴重影響，傳統(tǒng)治療方式療效不理想。組織工程技術(shù)在臨床應(yīng)用方面進行了初步嘗試，為臨床軟骨缺損修復(fù)提供了新的思路與途徑?，F(xiàn)就組織工程種子細胞的研究進展進行綜述。

【關(guān)鍵詞】軟骨；組織工程；種子細胞

關(guān)節(jié)軟骨沒有血管、神經(jīng)及淋巴組織，一旦損傷后自我修復(fù)能力十分有限［1］。軟骨損傷的發(fā)病率較高，在運動員等特殊人群中發(fā)病率更高，以往的關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)、微骨折術(shù)等手術(shù)方式效果并不理想［2］，術(shù)后軟骨缺損區(qū)尚無軟骨生成或僅能生成纖維軟骨，不能徹底修復(fù)軟骨缺損。自“組織工程”的概念問世以來，學(xué)者們一直在嘗試用各種組織工程方法修復(fù)軟骨缺損，組織工程的研究范疇主要包括種子細胞、支架材料和細胞因子，然而，不同的種子細胞在表型和增殖能力等方面都有差異，種子細胞的選擇對組織工程的研究至關(guān)重要。筆者主要對軟骨組織工程種子細胞源的研究進展進行綜述。

1　取材要求及臨床應(yīng)用

組織工程的種子細胞源應(yīng)符合以下要求：（1）來源廣泛，取材方便；（2）增殖能力強；（3）表型穩(wěn)定；（4）與支架材料的黏附率高；（5）對供區(qū)的損傷??；（6）無明顯免疫排斥反應(yīng)，生物安全性高；（7）植入體內(nèi)后能有效地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，并且有明確的遠期療效。目前，軟骨組織工程技術(shù)在各個領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用［3］，如軟骨細胞移植可應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)、氣管軟骨修復(fù)、耳廓的重建、骨不連的治療等領(lǐng)域；骨髓間充質(zhì)干細胞可用于修復(fù)軟骨缺損，治療肌腱、韌帶、椎間盤、半月板等結(jié)締組織的損傷，還可防止關(guān)節(jié)軟骨的退行性變發(fā)生，將外源基因?qū)牍撬栝g充質(zhì)干細胞可有效地表達，從而達到治療相應(yīng)疾病的目的。國外已初步對組織工程修復(fù)軟骨缺損進行了探索，但缺乏大樣本及長期隨訪研究，且對治療效果的評估缺乏統(tǒng)一的客觀標準［3］。在軟骨組織工程的應(yīng)用過程中，生物反應(yīng)器技術(shù)可使組織均勻混合，精確控制基質(zhì)的生成比例，有利于保持組織的活性，近年應(yīng)用較多的生物反應(yīng)器有機械攪拌式生物反應(yīng)器、微載體生物反應(yīng)器、灌注式生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)式微重力生物反應(yīng)器。

2　種類

2.1軟骨細胞 軟骨細胞因取材方便、免疫排斥反應(yīng)小等優(yōu)點是軟骨組織工程種子細胞的重要來源［4］。按照軟骨種子細胞的不同來源又可細分為自體軟骨細胞、異種軟骨細胞及同種異體軟骨細胞。因異種軟骨細胞雖來源廣泛，但免疫原性較強，應(yīng)用較少，故不作詳細論述。

2.1.1自體軟骨細胞 從患者體內(nèi)獲得軟骨組織后，可通過胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶獲得大量純度較高的自體軟骨細胞。有學(xué)者研究表明自體軟骨細胞移植技術(shù)修復(fù)軟骨缺損療效滿意，術(shù)后對新生軟骨行組織切片檢查證實新生軟骨為透明軟骨［5，6］。軟骨細胞來源于自體，不存在免疫排斥，但是自體軟骨細胞來源較為局限，增殖能力低下。膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者進行軟骨細胞移植手術(shù)前，需從膝關(guān)節(jié)非負重區(qū)獲取健康的關(guān)節(jié)軟骨體外消化培養(yǎng)，這就增加了供區(qū)術(shù)后疼痛和骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率。在體外實驗過程中發(fā)現(xiàn)軟骨細胞傳至3代以后生長緩慢，會失去原有的形狀，細胞表型發(fā)生改變，發(fā)生去分化。3代之前軟骨細胞特異性表達Ⅱ型膠原，3代以后轉(zhuǎn)為表達Ⅰ型和Ⅲ型膠原，蛋白多糖分泌減少，成軟骨能力減弱。隨著年齡增長會導(dǎo)致軟骨細胞活性逐漸下降，自體軟骨細胞移植不太適合年齡較大的患者，這也是自體軟骨細胞作為軟骨組織工程種子細胞的局限所在，然而軟骨細胞在體外培養(yǎng)的過程中，接種密度較低容易發(fā)生去分化，而在接種密度高細胞培養(yǎng)時就不存在這一問題［7］。Robinson等［8］認為，軟骨細胞在聚集培養(yǎng)的過程中，分泌的生長因子在局部積聚，并且細胞和細胞基質(zhì)不斷地進行信號傳導(dǎo)，有利于維持和恢復(fù)細胞表型。因此，在軟骨細胞體外培養(yǎng)的過程中，接種密度不應(yīng)過低。生物反應(yīng)器通過控制培養(yǎng)環(huán)境的pH、營養(yǎng)等，模擬細胞在體內(nèi)生長的微環(huán)境，為細胞生長提供適宜的條件。軟骨細胞在生物反應(yīng)器內(nèi)進行三維培養(yǎng)時可快速擴增，從而可獲得表型穩(wěn)定的永生化軟骨細胞。

2.1.2同種異體軟骨細胞 關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)組成，軟骨細胞存在于細胞外基質(zhì)形成的軟骨陷窩中，可阻擋免疫細胞的攻擊，故同種異體軟骨細胞進行移植時免疫反應(yīng)較輕微。并且，軟骨細胞在體外培養(yǎng)的過程中經(jīng)過酶消化等步驟后，抗原被處理，免疫原性降低。即使嚴重的免疫排斥反應(yīng)也可通過免疫抑制劑消除。同種異體軟骨細胞來源較廣，關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨及耳軟骨等均可作為其來源。一次消化可獲得充足的軟骨細胞，可有效解決細胞來源不足的問題。國外已有學(xué)者報道過同種異體軟骨細胞移植在修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損方面取得了滿意的療效［9］。但是同種異體軟骨細胞移植有可能傳播疾病，并且在獲取的過程中對供體也造成一定傷害。

2.2骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）BMSCs來源于中胚層，存在于骨髓中，具有高度自我更新和多向分化的能力［10］。BMSCs因來源廣泛、分化能力強越來越受到學(xué)者們的重視。Kurod等［11］研究顯示，自體BMSCs移植不存在免疫排斥反應(yīng)，為安全的種子細胞來源。分離BMSCs的辦法也比較多，最常用的是密度梯度離心法和貼壁分離法。密度梯度離心法獲得的原代細胞純度高，但細胞活性低，貼壁數(shù)量少；貼壁分離法可通過換液去除雜質(zhì)和不貼壁的細胞，獲得的細胞純度較高。BMSCs有向骨、軟骨、脂肪分化的能力，包含血小板衍生生長因子、β轉(zhuǎn)化生長因子、堿性成纖維細胞生長因子-2、表皮細胞生長因子等多種細胞因子均可誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細胞分化［12］。為確定獲得的細胞確實為BMSCs而非其它成纖維樣細胞，需使用流式細胞儀對其進行鑒定。CD44、CD90、CD105是鑒定BMSCs的陽性表面標志，CD34、CD45為陰性表面標志［13］。陽性表面標志和陰性表面標志的百分比與細胞的純度呈正比。雖然BMSCs的增殖能力和分化能力較強，但其數(shù)量較少，僅占全骨髓的1/105～1/104。BMSCs對分化成軟骨細胞所需的誘導(dǎo)條件要求較高，但也有研究表明重度骨性關(guān)節(jié)炎患者BMSCs的成軟骨能力明顯減弱［14］。BMSCs傳代至90代后可發(fā)生癌變，故對其作為軟骨組織工程的種子細胞來源應(yīng)保持警惕。

2.3脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）ADSCs同樣來自于中胚層，具有多向分化潛能，并且有免疫抑制作用［15］。ADSCs在含地塞米松、維生素、胰島素等組成的成軟骨誘導(dǎo)液分化后，可分化為軟骨細胞。因CD49在ADSCs中陽性表達，CD106陰性表達，CD34為低水平表達，可據(jù)此對ADSCs進行鑒定［16］。ADSCs來源廣泛，取材方便，對供體損傷較小，并且細胞含量豐富，ADSCs的粘附與增殖能力與供者的年齡無關(guān)，僅與體質(zhì)有關(guān)，是比較理想的種子細胞來源［17］。但Winter等［18］研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs與BMSCs相比成軟骨能力要弱。ADSCs在三維培養(yǎng)環(huán)境中高密度培養(yǎng)進行成軟骨誘導(dǎo)時可形成軟骨細胞，在單層培養(yǎng)環(huán)境中進行成軟骨誘導(dǎo)則成軟骨失敗。因此，在ADSCs應(yīng)用于軟骨組織工程方面還需要進一步的研究。2.4 胚胎干細胞 胚胎干細胞具有分化為三胚層的潛能，在適當(dāng)?shù)臈l件下可分化為所有組織器官類型的細胞。目前已經(jīng)有研究證實胚胎干細胞可在支架材料中進行生長、擴增和分化［19］。Kramer等［20］研究表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4能促進胚胎干細胞向軟骨細胞分化。與軟骨細胞相比，胚胎干細胞具有很強的再生能力和分化潛能，能很好地完成細胞的更新，這是其作為軟骨組織工程種子細胞的優(yōu)勢。但是目前胚胎干細胞用于臨床治療尚存在倫理學(xué)問題，本身具有致瘤性和免疫原性，并且體外培養(yǎng)條件要求嚴格，這就限制了胚胎干細胞在軟骨組織工程中的進一步應(yīng)用。

2.5臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）臍帶連于胚胎臍部與胎盤間，從中可分離出UCMSCs，并且成功率很高［21］。UCMSCs在體外培養(yǎng)時貼壁生長，具有成纖維細胞的形態(tài)。UCMSCs除表達間充質(zhì)干細胞的表面標志外，還表達胚胎轉(zhuǎn)錄因子Nanog等更原始的表面分子［22］。酶消化法和組織塊培養(yǎng)法是目前消化分離UCMSCs的主要方法，酶消化法的缺點在于有可能損傷細胞并破壞細胞表面標志［23］。組織塊培養(yǎng)法雖簡單可控，但培養(yǎng)時間較長，組織塊貼壁不牢固并且容易污染。Deans等［24］研究發(fā)現(xiàn)UCMSCs可不被同種異體T細胞識別和排斥，不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液對UCMSCs進行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細胞會分泌較多的的Ⅱ型膠原。另外，臍帶中富含透明質(zhì)酸、糖胺聚糖以及膠原，是透明軟骨的重要細胞外基質(zhì)，與天然軟骨的細胞外成分極為相似。并且，臍帶屬于廢棄物，來源較為廣泛，價格低廉，不存在倫理問題。因此，人臍帶間充質(zhì)干細胞很有可能會成為未來軟骨組織工程研究的重點。

2.6滑膜間充質(zhì)干細胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）自從2001年成功分離出SMSCs以來，學(xué)者們對它的研究就從未停止過。SMSCs來源于關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層（滑膜層），屬于間葉細胞。酶消化法和組織塊接種法均可成功分離SMSCs。SMSCs在體外培養(yǎng)時既有圓形的巨噬樣細胞，也有紡錘形的成纖維樣細胞。培養(yǎng)初期兩種細胞混合存在，但成纖維樣細胞增殖的速度要比巨噬樣細胞快得多，當(dāng)細胞融合至90％以后，視野中幾乎全為成纖維樣細胞?；らg充質(zhì)干細胞的增殖能力比骨髓間充質(zhì)干細胞高［25］。流式細胞儀檢測SMSCs表達CD44、CD90，不表達CD34、CD45［26，27］。SMSCs不表達Ⅱ類組織相容性抗原RLADQ，其免疫原性較低，不會或很少發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。因此SMSCs可用于同種異體移植，為組織工程的研究帶來了一線生機［28］。并且SMSCs是正常的二倍體細胞，無致瘤性，安全可靠，與BMSCs基因譜相比，SMSCs基因譜與軟骨細胞基因譜更為接近［29］。Dry等［30］進行的一項研究表明Ca2+可促進SMSCs增殖，高峰出現(xiàn)在Ca2+濃度為5.0 mmol/L時，可以通過適當(dāng)補充Ca2+以加速SMSCs增殖；而與胎牛血清相比，人血清也能加速SMSCs增殖。

2.7基因修飾后的細胞 基因修飾可通過轉(zhuǎn)染等技術(shù)將目的基因?qū)氚屑毎?，使其表達轉(zhuǎn)化生長因子等達到修復(fù)組織缺損的目的。該技術(shù)在骨髓間充質(zhì)干細胞中應(yīng)用的最為廣泛。軟骨細胞轉(zhuǎn)染后生存率較高，毒性小，長期培養(yǎng)過程中分化成軟骨的能力沒有變化。

將BMP-2和BMP-4轉(zhuǎn)入胚胎干細胞內(nèi)以后，胚胎干細胞可向軟骨細胞分化。并且，基因修飾后的軟骨細胞有很強的生物學(xué)功能，可很好地解決自體軟骨細胞供量不足的問題，縮短體外培養(yǎng)時間，維持軟骨細胞的表型。包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、脂質(zhì)體在內(nèi)的多種載體均可成功轉(zhuǎn)染軟骨細胞。但是，Seo等［31］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的目的基因可以破壞宿主本身的基因結(jié)構(gòu)，而且目的基因表達的生長因子長期過多表達會對靶細胞帶來改變。不僅如此，轉(zhuǎn)染后的細胞分泌的糖胺聚糖和Ⅱ型膠原的量會減少，這就限制了該技術(shù)的進一步應(yīng)用。故該技術(shù)的安全性和可靠性仍需進一步的研究證實。

自“組織工程”的概念提出以來，學(xué)者們一直在尋找合適的細胞作為種子細胞。隨著學(xué)者們研究的不斷深入，軟骨細胞、BMSCs、ADSCs等種子細胞逐漸應(yīng)用于組織工程中。然而，每一類種子細胞都有其自身的優(yōu)缺點。因此，還需要后續(xù)的進一步研究來探討各類種子細胞的特點，并積極尋找新型種子細胞以擴充組織工程的種子細胞庫。種子細胞篩選、培養(yǎng)和組織構(gòu)建的規(guī)范化及安全性評價將是今后的研究方向，當(dāng)組織工程真正應(yīng)用于臨床，將能解決較多難題。

【參考文獻】

［1］李志鴻，李 煜，李素梅.骨軟骨組織工程的研究進展［J］.醫(yī)藥前沿，2015，5（9）：72-73.

［2］呂 順，周軍杰，謝曉濤.軟骨組織工程種子細胞獲取培養(yǎng)及鑒定研究進展［J］.中國骨與關(guān)節(jié)雜志，2015，4（11）：864-867.

［3］張瑩瑩，周廣東，曹誼林.軟骨組織工程的研究進展［J］.組織工程與重建外科雜志，2011，7（6）：340-343.

［4］張世浩，朱立新.關(guān)節(jié)軟骨組織工程種子細胞的研究進展［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2008，22（12）：1505-1507.

［5］Zhang Z，Zhong X，Ji H，et al.Matrix-induced autologous chondrocyte implantation for the treatment of chondral defects of the knees in Chinese patients［J］.Drug Design Devel Ther，2014，8（5）：2439-2448.

［6］張仲文，侯世科，楊造成.基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細胞移植術(shù)修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損10 例術(shù)后2年的隨訪［J］.中華關(guān)節(jié)外科雜志，2010，4（6）：734-741.

［7］叢 波，張加廷，韓 龍.兔軟骨細胞的分離及其與Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜共培養(yǎng)實驗研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2016，26（7）：4-8.

［8］Robinson D，Ash H，Yayon A，et al.Characteristics of cartilage biopsies used for autologous chondrocytes transplantation［J］.Cell Transplant，2001，10（2）：203-208.

［9］Boopalan P R，Sathishkumar S，Kumar S，et al.Rabbit articular cartilage defects treated by allogenic chondrocyte transplantation［J］.Int Orthop，2006，30（5）：357-361.

［10］虞冀哲，董學(xué)海，陳海丹.間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于軟骨組織工程的研究進展［J］.生物骨科材料與臨床研究，2015，12（4）：60-64.

［11］Kuroda R，Usas A，Kubo S，et al.Cartilage repair using bone morphogenetic protein 4 and muscle-derived stem cells［J］.Arthritis Rheum，2006，54（2）：433-442.

［12］劉瑾春，劉 霞，曹誼林.體外誘導(dǎo)BMSCs 向軟骨分化的方法研究進展［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2011，25（5）：618-623.

［13］潘欣宇，崔 穎，馬林祥.不同來源骨髓間充質(zhì)干細胞的體內(nèi)成軟骨［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（49）：9128-9132.

［14］Murphy M，Dixon K，Beck S，et al.Reduced chondrogenic and adipogenic activity of mesenchymal stem cells from patients with advanced osteoarthritis［J］.Arthritis Rheum，2002，46（3）：704-713.

［15］Technau A，F(xiàn)roelich K，Hagen R，et al.Adipose tissue-derived stem cells show both immunogenic and immunosuppressive properties after chondrogenic differentiation［J］.Cytotherapy，2011，13（3）：310-317.［16］安榮澤，趙俊延，王兆杰.脂肪干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨能力的比較［J］.中國組織工程研究，2013，17（32）：5793-5798.

［17］Estes B T，Diekman B O，Gimble J M，et al.Isolation of adipose-derived stem cells and their induction to a chondrogenic phenotype［J］.Nat Protoc，2010，5（7）：1294-1311.

［18］Winter A，Breit S，Parsch D，et al.Cartilage-like gene expression in differentiated human stem cell spheroids：a comparison of bone marrow-derived and adipose tissuederived stromal cells［J］.Arthritis Rheum，2003，48（2）：418-429.

［19］Newman K D，Mc Burney M W.Poly（D，L lactic-coglycolic acid）microspheres as biodegradable microcarriers for pluripotent stem cells［J］.Biomaterials，2004，25（26）：5763-5771.

［20］Kramer J，Hegert C，Guan K，et al.Embryonic stem cellderived chondrogenic differentiation in vitro：activation by BMP-2 and BMP-4［J］.Mech Dev，2000，92（2）：193-205.

［21］Zeddou M，Briquet A，Relic B，et al.The umbilical cord matrix is a better source of mesenchymal stem cells（MSC）than the umbilical cord blood［J］.Cell Biol Int，2010，34（7）：693-701.

［22］Montanucci P，Basta G，Pescara T，et al.New simple and rapid method for purification of mesenchymal stem cells from the human umbilical cord Wharton jelly［J］.Tissue Eng Part A，2011，17（21-22）：2651-2661.

［23］Majore I，Moretti P，Stahl F，et al.Growth and differentiation properties of mesenchymal stromal cell populations derived from whole human umbilical cord［J］.Stem Cell Rev，2011，7（1）：17-31.

［24］Deans R J，Moseley A B.Mesenchymal stem cells：biology and potential clinical uses［J］.Exp Hematol，2000，28（8）：875-884.

［25］芮云峰，林禹丞，陳 輝.晚期骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)滑膜間充質(zhì)干細胞的體外成骨分化［J］.中國組織工程研究，2013，17（45）：7840-7846.

［26］陳 松，符培亮，叢銳軍.人滑膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定［J］.中國骨與關(guān)節(jié)外科，2014，7（2）：146-151.

［27］袁 洋.滑膜間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性及其在軟骨組織工程中應(yīng)用的研究進展［J］.海南醫(yī)學(xué)，2015，26（2）：214-217.

［28］陳 松，符培亮，吳海山.滑膜間充質(zhì)干細胞在軟骨修復(fù)組織工程中的研究進展［J］.中華關(guān)節(jié)外科雜志，2013，7（5）：707-710.

［29］Segawa Y，Muneta T，Makino H，et al.Mesenchymal stem cells derived from synovium，meniscus，anterior cruciate ligament，and articular chondrocytes share similar gene expression profiles［J］.J Orthop Res，2009，27（4）：435-441.

［30］Dry H，Jorgenson K，Ando W，et al.Effect of calcium on the proliferation kinetics of synovium-derived mesenchymal stromal cells［J］.Cytotherapy，2013，15（7）：805-819.

［31］Seo S，Na K.Mesenchymal stem cell-based tissue engineering for chondrogenesis［J］.J Biomed Biotechnol，2011，2011（1）：806891-806898.

（2016-03-01 收稿2016-05-26 修回）

（責(zé)任編輯潘奕婷）

Research progress on the source of seed cells in cartilage tissue engineering

CONG Bo and ZHANG Zhongwen. The Fourth Department of Orthopedics，General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces，Beijing 100039，China Corresponding author：ZHANG Zhongwen，E- mail：zhang6816151@163.com

【Abstract】The morbidity of articular cartilage defects is high.Consequently，life qualities of patients with articular cartilage defects are severely affected；effects of traditional treatment are not good.Tissue engineering techniques has been applied to preliminary clinical practice which showed a promising approach for reparation of cartilage defect.This review focuses on the research development regarding seed cells of cartilage tissue engineering.

【Key words】cartilage；tissue engineering；seed cells

【中國圖書分類號】R318

DOI：10.13919/j.issn.2095-6274.2016.06.011

基金項目：“首都臨床特色應(yīng)用研究”項目（Z161100000516013）； 武警總醫(yī)院一類課題（WZ2012016）

作者簡介：叢 波，碩士研究生在讀，E-mail：635254548@qq.com

作者單位：100039 北京，武警總醫(yī)院骨四科

通訊作者：張仲文，E-mail：zhang6816151@163.com