食管癌Eca109細(xì)胞的HPV16-E6基因轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

康馨丹，陳衛(wèi)剛，阮開(kāi)學(xué)，張寧，鄭勇

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

食管癌Eca109細(xì)胞的HPV16-E6基因轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

康馨丹，陳衛(wèi)剛，阮開(kāi)學(xué)，張寧，鄭勇

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

目的 確定HPV16-E6基因轉(zhuǎn)染食管癌Eca109細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。方法 取體外培養(yǎng)的食管癌Eca109細(xì)胞，用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組，轉(zhuǎn)染條件控制因素包括DNA用量、Lip2000/DNA和饑餓時(shí)間，DNA用量分0.65、1.00、1.50、2.00、2.35 μg共5檔，Lip2000/DNA分0.65、1.00、1.50、2.00、2.35 μL/μg共5檔，饑餓時(shí)間分0、3、7.5、12、15 h共5檔，共設(shè)20個(gè)組。轉(zhuǎn)染24 h后，倒置顯微鏡下觀察各組熒光情況并拍照，用圖像處理軟件計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；用CCK-8法測(cè)算各組細(xì)胞相對(duì)存活率。用響應(yīng)曲面法繪制有交互影響的因素對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和相對(duì)存活率影響的響應(yīng)曲面，以目的基因細(xì)胞數(shù)(轉(zhuǎn)染效率×細(xì)胞存活率)最大化為原則，確定最佳轉(zhuǎn)染條件。在最佳轉(zhuǎn)染條件下用HPV16-E6基因轉(zhuǎn)染食管癌Eca109細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和相對(duì)存活率。結(jié)果 隨著饑餓時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞相對(duì)存活率呈下降趨勢(shì)。依據(jù)饑餓0 h的轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞存活率響應(yīng)曲面圖，得出最佳轉(zhuǎn)染條件為(24孔培養(yǎng)板)：DNA用量1.35 μg、Lip2000/DNA1.12 μL/μg(換算成Lip2000用量為1.51 μL)、細(xì)胞饑餓時(shí)間0 h；轉(zhuǎn)染效率預(yù)測(cè)值可達(dá)38.68 %，細(xì)胞相對(duì)存活率預(yù)測(cè)值為85.09%。在最佳轉(zhuǎn)染條件下用相同方法轉(zhuǎn)染，實(shí)際轉(zhuǎn)染效率為39.79 %，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.87%。結(jié)論 HPV16-E6基因轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件(24孔板)為：每孔DNA用量1.35 μg，脂質(zhì)體Lip2000用量1.51 μL，不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理。

食管癌；人乳頭瘤病毒16；基因轉(zhuǎn)染效率；細(xì)胞相對(duì)存活率；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

人乳頭狀瘤病毒(HPV)是一種具有高度特異性的嗜上皮性病毒，與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)，HPV16黏膜高危亞型與食管癌發(fā)病的關(guān)系尤其密切[1，2]，但其相關(guān)程度以及HPV對(duì)食管癌細(xì)胞的作用機(jī)制并沒(méi)有明確的定論[3,4]。研究HPV16對(duì)食管癌細(xì)胞的影響首先要通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將HPV16核酸片段轉(zhuǎn)染入食管癌細(xì)胞中。陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是常用轉(zhuǎn)染方法，但是轉(zhuǎn)染目標(biāo)DNA和所用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Lip2000)本身有一定的細(xì)胞毒性，過(guò)量應(yīng)用可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率降低。轉(zhuǎn)染前是否應(yīng)該行饑餓處理目前也有爭(zhēng)議。本研究通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將搭載致癌基因HPV16-E6的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入Eca109食管癌Eca109細(xì)胞中，并通過(guò)中心復(fù)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析轉(zhuǎn)染條件(DNA用量、Lip2000/DNA、饑餓時(shí)間)對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞相對(duì)存活率的影響，構(gòu)建轉(zhuǎn)染效率如細(xì)胞相對(duì)存活率的響應(yīng)曲面，確定HPV16-E6基因轉(zhuǎn)染食管癌Eca109細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Eca109型食管癌細(xì)胞株由石河子大學(xué)地方高發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。綠色熒光蛋白標(biāo)記的搭載 HPV16-E6基因片段的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒由上海生工生物工程公司構(gòu)建。陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lip2000購(gòu)自Invitrogen公司。Opti-MEM培養(yǎng)液、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自HyClone公司。質(zhì)粒提取純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技公司。Loading buffer上樣緩沖液、PBS細(xì)胞緩沖液、24孔與96孔培養(yǎng)板。熒光倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品。CO2培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、核酸濃度分析儀、低溫高速離心機(jī)為T(mén)hermo Fisher公司產(chǎn)品。酶標(biāo)儀、電泳儀、紫外凝膠成像儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 食管癌Eca109細(xì)胞分組及 HPV16-E6基因細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法

Eca109細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并加入適量的青-鏈霉素混合液，置于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液1次，細(xì)胞融合度80 %左右傳代。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，使用胰蛋白酶將細(xì)胞消化，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)量為1×105個(gè)，培養(yǎng)條件保持不變，細(xì)胞融合度達(dá)到70 %左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)1～20組，各組DNA用量、Lip2000/DNA和饑餓時(shí)間見(jiàn)表1。各組先用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基對(duì)Eca109細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，達(dá)到規(guī)定的饑餓時(shí)間后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。各組抽取相應(yīng)量的的質(zhì)粒DNA稀釋于50 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，抽取相應(yīng)的脂質(zhì)體Lip2000，同樣稀釋于50 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min后將二者混合均勻，并靜置25 min得到DNA-Lip2000復(fù)合物。將上述復(fù)合物均勻滴入各培養(yǎng)孔，然后把培養(yǎng)板放入37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中，5 h后更換為含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

表1 各組轉(zhuǎn)染條件

1.3 各組轉(zhuǎn)染效果評(píng)價(jià) 包括細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞相對(duì)存活率兩方面。

1.3.1 各組基因轉(zhuǎn)染效率測(cè)算 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于熒光倒置顯微鏡下放大100倍，每組隨機(jī)選取10個(gè)視野，分別在可見(jiàn)光和熒光濾鏡下拍照。使用圖像處理軟件Image J進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和熒光計(jì)數(shù)，通過(guò)熒光數(shù)/細(xì)胞數(shù)折算出每個(gè)視野下的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，求加權(quán)平均數(shù)后，最終得出各組的轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 各組細(xì)胞相對(duì)存活率測(cè)算 采用CCK-8法，另設(shè)空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)液，無(wú)細(xì)胞)，轉(zhuǎn)染24 h后，向各試驗(yàn)組中加入10 μL的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育1 h左右，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的光密度(OD)值。各組細(xì)胞相對(duì)存活率=(各組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.5 最佳轉(zhuǎn)染條件的轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證 在最佳轉(zhuǎn)染條件下用1.2中的方法轉(zhuǎn)染，用1.3中的方法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和相對(duì)存活率。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和相對(duì)存活率 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和相對(duì)存活率見(jiàn)表2。

表2 各組基因轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞相對(duì)存活率

2.2 最佳轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化結(jié)果 多元非線(xiàn)性回歸分析結(jié)果顯示DNA用量、Lip2000/DNA、饑餓時(shí)間均對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率有顯著影響，因素顯著性的主次順序?yàn)椋吼囸I時(shí)間>Lip2000/DNA>DNA用量；且DNA用量與Lip2000/DNA對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響存在顯著交互作用，而其他因素之間則無(wú)顯著交互作用。DNA用量、Lip2000/DNA和饑餓時(shí)間均對(duì)細(xì)胞相對(duì)存活率有顯著影響，顯著性的主次順序?yàn)椋吼囸I時(shí)間>Lip2000/DNA>DNA用量；三者對(duì)細(xì)胞相對(duì)存活率的影響無(wú)交互作用。

DNA用量對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響具有兩面性。隨著DNA用量增加，轉(zhuǎn)染效率先逐漸增大，在DNA用量為1.35 μg左右達(dá)到最大值，此后隨著DNA的增加逐漸減小。DNA用量與細(xì)胞相對(duì)存活率呈非線(xiàn)性負(fù)相關(guān)，隨著DNA用量增加，細(xì)胞存活率呈加速下降趨勢(shì)，當(dāng)DNA用量達(dá)到2.35 μg時(shí)，細(xì)胞存活率僅為40 %左右。

Lip2000/DNA比值對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響同樣具有兩面性。當(dāng)Lip2000/DNA從0.65 μL/μg增大至1.2 μL/μg時(shí)，轉(zhuǎn)染效率由25%提升至30%；當(dāng)Lip2000/DNA從1.2 μL/μg增大至2.35 μL/μg時(shí)，轉(zhuǎn)染效率開(kāi)始急劇下降，下降幅度達(dá)到20%。當(dāng)Lip2000/DNA在0.65～1.2 μL/μg的區(qū)間內(nèi)，細(xì)胞細(xì)胞相對(duì)存活率保持相對(duì)穩(wěn)定；當(dāng)Lip2000/DNA從1.2 μL/μg增大至2.35 μL/μg時(shí)，細(xì)胞相對(duì)存活率呈加速下降趨勢(shì)。

隨著饑餓時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞相對(duì)存活率呈下降趨勢(shì)。

饑餓時(shí)間與DNA用量、Lip2000/DNA之間不存在顯著交互作用，并且對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率的影響均為單調(diào)抑制作用，因此在細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)不進(jìn)行饑餓處理更為適宜。饑餓0 h的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率響應(yīng)曲面見(jiàn)圖1。最高轉(zhuǎn)染效率位于響應(yīng)曲面的中間區(qū)域。當(dāng)DNA用量在1.2 ～1.8 μg區(qū)間內(nèi)、Lip2000/DNA在0.9～1.5區(qū)間內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率可保持在35%以上。饑餓0 h的細(xì)胞存活率響應(yīng)曲面件圖2。DNA和Lip2000用量與細(xì)胞存活率的影響呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)DNA用量與Lip2000/DNA均處于低水平時(shí)，細(xì)胞存活率可達(dá)最大值。DNA用量在0.65 ～1.6 μg區(qū)間內(nèi)、Lip2000/DNA在0.65～1.4區(qū)間內(nèi)，細(xì)胞存活率可保持在70%以上。

以目的基因細(xì)胞數(shù)(轉(zhuǎn)染效率×細(xì)胞存活率)最大化為原則，通過(guò)響應(yīng)曲面法得出最佳轉(zhuǎn)染條件為(24孔培養(yǎng)板)：DNA用量1.35 μg、Lip2000/DNA為1.12 μL/μg(Lip2000用量1.51 μL)、細(xì)胞饑餓時(shí)間0 h；轉(zhuǎn)染效率預(yù)測(cè)值可達(dá)38.68%，細(xì)胞相對(duì)存活率預(yù)測(cè)值為85.09%。

2.3 最佳轉(zhuǎn)染條件的轉(zhuǎn)染效果 在最佳轉(zhuǎn)染條件下用相同方法轉(zhuǎn)染食管癌Eca109細(xì)胞，實(shí)際轉(zhuǎn)染效率為39.79%，與響應(yīng)曲面預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為2.87%。

3 討論

陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是目前常用的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)之一[6]，在使用脂質(zhì)體Lip2000將目的基因轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的過(guò)程中，轉(zhuǎn)染效率會(huì)受到諸多因素的影響，因此對(duì)轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化必不可少。轉(zhuǎn)染過(guò)程中DNA和脂質(zhì)體均有導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的作用。為了盡可能多的獲取攜帶HPV16-E6基因的食管癌細(xì)胞，在提高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，還需考慮細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后的存活率。

本研究結(jié)果顯示，DNA用量、Lip2000/DNA和饑餓時(shí)間這三個(gè)因素對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞相對(duì)存活率都有影響，并且DNA用量與Lip2000/DNA對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響存在顯著的交互作用。增大DNA用量可形成更多的核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物，有利于提高轉(zhuǎn)染效率，但是細(xì)胞本身對(duì)DNA的吸收存在飽和度，且過(guò)多的DNA會(huì)導(dǎo)致核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物的氮磷比失衡[7]，細(xì)胞毒作用增強(qiáng)，因此過(guò)量的DNA會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。適量的提高Lip2000用量可與DNA結(jié)合更加充分，形成的核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物具有更穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，能有效提高轉(zhuǎn)染效率[8]。但是，當(dāng)Lip2000/DNA值較大時(shí)，過(guò)量的Lip2000分子以游離狀態(tài)存在，將細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷中和，從而削弱細(xì)胞膜對(duì)核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物的吸附能力，造成轉(zhuǎn)染效率降低；另一方面，Lip2000本身對(duì)細(xì)胞也具有毒性，這是其造成細(xì)胞相對(duì)存活率下降的主要原因[9]。轉(zhuǎn)染前對(duì)食管癌細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理的目的在于，使細(xì)胞處于靜息狀態(tài)而達(dá)到細(xì)胞周期的同步化，同時(shí)消除血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響[10]。有文獻(xiàn)[11]提出，處于饑餓狀態(tài)的細(xì)胞可以更好的吸收轉(zhuǎn)染試劑，在一定程度上可以提高轉(zhuǎn)染效率。而本研究結(jié)果表明，饑餓處理會(huì)降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，過(guò)度饑餓會(huì)使細(xì)胞狀態(tài)變差，內(nèi)吞和膜融合活動(dòng)減弱，并且造成細(xì)胞損傷，不能有效的抵抗DNA和脂質(zhì)體的毒性作用。另外，饑餓處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞沒(méi)有足夠的營(yíng)養(yǎng)維持生長(zhǎng)，會(huì)逐漸裂解、死亡，細(xì)胞相對(duì)存活率下降。

根據(jù)響應(yīng)曲面對(duì)轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化得出：在24孔培養(yǎng)板上行HPV16-E6基因轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，每孔DNA用量1.35 μg，脂質(zhì)體Lip2000用量1.51 μL，且不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理時(shí)，理論上轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到最大值，實(shí)際轉(zhuǎn)染效率為39.79%，完全可滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。

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Optimal transfection conditions for HPV16-E6 gene in esophageal cancer Eca109 cells

KANGXindan,CHENWeigang,RUANKaixue,ZHANGNing,ZHENGYong

(TheFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversityMedicalCollege,Shihezi832000,China)

Objective To find the optimal transfection conditions for transfecting HPV16-E6 plasmid to esophageal cancer Eca109 cells. Methods The in vitro cultured Eca109 cells were selected. We used central composite experiment to design the groups. The control factors of transfection conditions included DNA dosage (0.65, 1.00, 1.50, 2.00, and 2.35 μg), Lip2000/DNA (0.65, 1.00, 1.50, 2.00, and 2.35 μL/μg) and starvation time (0, 3, 7.5, 12, and 15 h) and according to the above, we established 20 groups. After 24 h, the expression of green fluorescent was observed by inverted microscope and then was photographed. The transfection efficiency was evaluated by image processing software, and the cell proliferation by CCK-8. Response surface methodology was used to draw the response surface on effects of interaction factors on cell transfection efficiency and relative survival rate.The optimal transfection conditions were determined based on the principle of maximizing the number of target cells (transfection efficiency×cell survival rate). The transfection efficiency and relative survival rate of esophageal carcinoma Eca109 cells were detected by HPV16-E6 gene transfection under optimal transfection conditions.Results On the basis of cell transfection efficiency without starvation, the response surface showed that the highest transfection efficiency area was located in the middle of the response surface. Without starvation, the response surface of cell survival rate showed that the DNA and Lipo 2000 was negatively correlated with the survival rate. The optimal transfection conditions (24-well plate) determined based on the principle of maximizing the number of target cells (transfection efficiency×cell survival rate): the plasmid amount was 1.35 μg, Lipo2000/DNA ratio was 1.12∶1 μg/μL (converted to Lip2000 dosage of 1.51 μL) and the starvation time was 0 h. The predicted value of transfection efficiency reached 38.68% and the cell survival rate was 85.09%. Under the optimal transfection conditions, the actual transfection efficiency was the highest (39.79%), with the relative error of 2.87% as compared with the predicted value. Conclusion The optimal transfection conditions for transfecting HPV16-E6 plasmid to Eca109 cells for 24-well plate are asfollows: 1.35 μg DNA per well, 1.51 μL Lip2000 liposome, and the cells are not starved.

esophageal cancer; human papillomavinus 16; gene transfection efficiency; cell relative survival rate; experimental design

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260362)。

康馨丹(1991-)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橄滥[瘤。E-mail: 75321631@qq.com

簡(jiǎn)介：鄭勇(1956-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)橄到y(tǒng)疾病。E-mail: zy2850@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.004

R735.1

A

1002-266X(2016)47-0013-04

2016-08-21)