人血清淀粉樣蛋白A1原核表達(dá)及膠體金檢測方法的建立

宋英林，趙玉環(huán)，褚春旭，張司晨，張曉

（1.長春理工大學(xué)校醫(yī)院，長春 130022；2.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

人血清淀粉樣蛋白A1原核表達(dá)及膠體金檢測方法的建立

宋英林1，趙玉環(huán)2，褚春旭2，張司晨2，張曉2

（1.長春理工大學(xué)校醫(yī)院，長春 130022；2.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

通過膠體金免疫層析技術(shù)建立一種特異、便捷、快速的SAA1定量檢測新方法。利用大腸桿菌BL21（DE3）原核表達(dá)人血清淀粉樣蛋白A1（SAA1），根據(jù)BL21（DE3）表達(dá)偏好性設(shè)計(jì)并合成SAA1蛋白基因片段，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-SAA1，采用CaCl2法制備BL21（DE3）感受態(tài)，熱激轉(zhuǎn)化法將pET-28a-SAA1轉(zhuǎn)入到BL21（DE3）。經(jīng)表達(dá)條件優(yōu)化，獲得重組蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：溫度30℃，時(shí)間6h，轉(zhuǎn)速180rpm/min，培養(yǎng)基pH 7.0，IPTG濃度0.4mM，誘導(dǎo)表達(dá)后目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，Ni柱純化、透析、濃縮從而獲得濃度為8.09mg/ml，純度為85%的SAA1。同時(shí)，結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)，建立了SAA1膠體金免疫層析試紙檢測方法，線性范圍0.16～500μg/ml，最低檢測限0.16μg/ml，該研究為臨床體外診斷SAA1快速檢測提供技術(shù)基礎(chǔ)。

人血清淀粉樣蛋白A1；原核表達(dá)；膠體金免疫層析；定量檢測

血清淀粉樣蛋白A（SAA）是一種主要的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，由肝細(xì)胞產(chǎn)生并釋放至血液循環(huán)。目前，細(xì)菌、病毒感染、冠心病、動脈粥樣硬化、腫瘤、急性移植排斥反應(yīng)等疾病中均檢測到血清SAA升高［1-3］。作為新型檢測指標(biāo)物，SAA正受到學(xué)者及臨床醫(yī)學(xué)越來越多的關(guān)注。

研究表明，人血清SAA在正常情況下表達(dá)水平較低，但在急性期感染狀態(tài)下，比CRP更靈敏，其在血清中的濃度能夠在極短時(shí)間內(nèi)升高100～1000倍［4］。另外，SAA和CRP的比值與小兒感染性疾病的嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，監(jiān)測SAA/CRP比值比單獨(dú)檢測SAA或CRP具有更大的應(yīng)用價(jià)值［5］。

人類Saa基因位于11號染色體短臂，包含4個(gè)基因：Saal、Saa2、Saa3和Saa4。與其它載脂蛋白相同，所有Saa基因均由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。根據(jù)體內(nèi)表達(dá)情況，SAA分為兩類：急性期SAA（acute SAA，A-SAA）和組成型SAA（constitutive SAA，C-SAA）。人類Saa家族中有2種基因編碼表達(dá)A-SAA，即Saa1和Saa2。Saa3基因由于在第3個(gè)外顯子（第41個(gè)密碼子處）有1個(gè)堿基插入，產(chǎn)生編碼位移，導(dǎo)致在第43個(gè)密碼子處產(chǎn)生翻譯終止信號，屬于假基因。C-SAA是Saa4在肝內(nèi)低水平表達(dá)的SAA蛋白分子［6］。SAA1由104個(gè)氨基酸構(gòu)成，其前端76個(gè)氨基酸被酶切后為淀粉樣蛋白A。SAA1初級結(jié)構(gòu)中某些氨基酸序列與其結(jié)合HDL、致淀粉樣纖維原形成及細(xì)胞粘黏等功能有關(guān)。其二級結(jié)構(gòu)為典型的球蛋白分子，具有僅螺旋和B折疊，并含有鈣離子和脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)［7］。

SAA1在體內(nèi)具有多種功能［8］，參與機(jī)體各種生理、病理反應(yīng)。主要包括：參與內(nèi)毒素解毒以及膽固醇代謝和轉(zhuǎn)移［9］；抑制免疫反應(yīng)［10］、血小板聚集、淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及趨化肽N甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰苯丙氨酸（fLMP）誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞反應(yīng)；誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)、前列腺素I的合成及細(xì)胞的黏附、遷移和浸潤等［11］。

目前，臨床診斷SAA1的檢測方法主要有放射性免疫測定法（RIA）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫速率散射比濁法［12］、微球捕獲酶免疫法（MEI A）等。檢測試劑均為進(jìn)口產(chǎn)品，具有較高敏感性和特異性，應(yīng)用自動化大型儀器進(jìn)行檢測，大大提高了SAA1在臨床疾病監(jiān)測中的應(yīng)用價(jià)值。但是目前國產(chǎn)成熟商品化SAA1檢測試劑較少，價(jià)格高，因此對該項(xiàng)指標(biāo)的臨床檢測尚未廣泛應(yīng)用。該項(xiàng)目采用膠體金免疫側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)［13］，同時(shí)，結(jié)合自主研發(fā)的膠體金檢測儀可以實(shí)現(xiàn)SAA1膠體金免疫層析定量檢測，提高了膠體金檢測法的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

儀器：GeneSYU型凝膠成像系統(tǒng)（英國基因有限公司）；Life Touch型PCR儀（北京東方安諾生化科技有限公司）；膠體金檢測儀器（長春理工大學(xué)）。

試劑：San Prep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，San Prep柱式DNA膠回收試劑盒，pUCm-T Vector，羊抗鼠多抗IgG（上海生工）；SAA1單克隆抗體購于武漢華美生物工程有限公司，其它試劑均為分析純，超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 原核表達(dá)載體pET-28a-SAA1的構(gòu)建

根據(jù)大腸桿菌BL21（DE3）密碼子偏好性合成了目的片段Saa1基因序列，同時(shí)包含Nde I和BamH I酶切位點(diǎn)，該基因片段與pUCm-T載體連接，構(gòu)成質(zhì)粒pUCm-T-SAA1。利用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I將質(zhì)粒pUCm-T-SAA1和pET-28a進(jìn)行雙酶切，將目的片段與pET-28a連接，獲得原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-SAA1［14］。然后，利用熱激轉(zhuǎn)化法將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆子置于LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 SAA1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將-80℃保存的原核表達(dá)菌株活化，37℃，180rpm/min，過夜培養(yǎng)12h，LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)2.5h，通過表達(dá)條件的優(yōu)化，可溶性SAA1最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為溫度30℃，時(shí)間6h，轉(zhuǎn)速180r/min，IPTG濃度0.4mM，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后用Ni離子親和層析柱進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離與純化，蛋白產(chǎn)物置于磷酸鹽緩沖溶液（PBS）透析20h，然后蔗糖濃縮8h。采用聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）對原核表達(dá)SAA1進(jìn)行鑒定。然后采用考馬斯亮蘭法測定原核表達(dá)SAA1蛋白濃度。

1.2.3 膠體金納米粒子制備

取100ml去離子水放入250ml錐形瓶中，磁力攪拌并加熱至100℃，然后加入氯金酸和檸檬酸（按照體積比1∶1），加熱計(jì)時(shí)8min，而后用去離子水定容至100ml。采用分光光度計(jì)測定制備膠體金最大吸收峰，掃描電子顯微鏡表征粒徑、形狀及分散度。

1.2.4 SAA1膠體金免疫層析試紙條制備

膠體金免疫層析試紙條制作是依次將樣品墊、噴涂膠體金-抗體復(fù)合物的結(jié)合墊、噴涂SAA1包被單克隆抗體檢測線（T線）與SAA1多克隆抗體質(zhì)控線（C線）的NC膜和吸水紙分別貼于PVC板上，樣品墊長度為2cm，結(jié)合墊長度為0.5cm，NC膜長度為2.5cm，吸水紙長度為2.0cm，然后用手功切條機(jī)將組裝好的PVC板切為寬帶0.4cm，即為制備的檢測用試紙條。

膠體金的檢測原理是將SAA1單抗與膠體金顆粒偶聯(lián)，在硝酸纖維素膜（NC膜）上分別包被SAA1單克隆抗體作為T線，多克隆抗體作為C線，樣品待檢液在毛細(xì)層析作用下沿NC膜側(cè)向流動，樣品液中含有的待測抗原與結(jié)合墊上的抗體發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物遷移到達(dá)檢測線時(shí)，被檢測線膠體金標(biāo)記抗體捕獲，從而產(chǎn)生富集和截留，呈現(xiàn)出肉眼可見的紫紅色，根據(jù)顏色有無可判斷陰性或陽性。

1.2.5 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

將SAA1標(biāo)準(zhǔn)品分布稀釋為0.16μg/ml、0.8μg/ ml、4μg/ml、20μg/ml、100μg/ml、500μg/ml；共制作36個(gè)檢測卡，即每濃度6個(gè)檢測卡。通過膠體金免疫層析檢測儀檢測膠體金吸光度，從而建立SAA1定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 批內(nèi)和批間重復(fù)性

在同樣的條件下，每批制作SAA1膠體金檢測試紙條60條，分別做3批，考察用加有標(biāo)準(zhǔn)品的小牛血清（0.8μg/ml）進(jìn)行檢測。

1.2.7 方法學(xué)比對

461醫(yī)院提供血清84份，利用市售ELISA方法SAA1檢測試劑盒與本方法檢測結(jié)果進(jìn)行對比，判斷本實(shí)驗(yàn)制備的免疫層析試紙條與市場檢測試劑盒的相關(guān)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 SAA1原核表達(dá)及純化

利用實(shí)驗(yàn)部分將構(gòu)建成功的pUCm-T-SAA1載體通過限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I將SAA1片段酶切下來與通過限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I酶切的空質(zhì)粒pET28a，連接成功，轉(zhuǎn)化后獲得多個(gè)陽性克隆，通過PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果如圖1所示，其測序結(jié)果如圖2所示，圖中為送去上海生工測序出的基因序列，與合成的目的基因序列一致。結(jié)果表明已經(jīng)成功構(gòu)建pET28a-SAA1。

如圖1所示，孔道1，2：DNA的標(biāo)準(zhǔn)Marker；孔道3，4，5，6：SAA1目的片斷。

圖1 PCR鑒定電泳圖

圖2 測序結(jié)果圖

將構(gòu)建成功的表達(dá)載體pET28a-SAA1熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中，以Kan抗性培養(yǎng)基平板篩選轉(zhuǎn)化子，利用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。重組表達(dá)載體pET28a-SAA1成功表達(dá)可溶性SAA1蛋白，其SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖3所示，對應(yīng)的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，同樣顯示出明亮條帶，其大小在14kD左右，以上結(jié)果均表明SAA1獲得了表達(dá)。

圖3 SDS-PAGE蛋白電泳圖

如圖3所示，孔道1：蛋白分子量Marker；孔道2：純化樣品；孔道3：未純化樣品；孔道4：洗雜液經(jīng)Ni離子親和層析純化后，采用考馬斯亮蘭法測定目的蛋白濃度為8.09mg/ml。

2.2 膠體金制備

利用紫外分光光度計(jì)測得最大吸收峰在528nm處，從而確定膠體金顆粒粒徑大約在40nm左右，利用透射電鏡來鑒定膠體金粒徑的大小、形狀及分散度的情況，并進(jìn)行合理的分析。所制備的膠體金顆粒分散均勻，粒徑的大小為40nm，能滿足實(shí)驗(yàn)需求。如圖4所示。

圖4 膠體金掃描電子顯微鏡的表征

2.3 SAA1標(biāo)準(zhǔn)曲線

SAA1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋系列梯度濃度，采用上述制備的膠體金免疫檢測試機(jī)卡對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測定，檢測吸收光強(qiáng)度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以SAA1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，采用EXCEL軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示，在0.16～500μg/ml范圍內(nèi)，吸光度值與SAA1標(biāo)準(zhǔn)品濃度呈正相關(guān)，線性方程為y= 0.261ln（x）+0.6026，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，其目測法檢出限為0.8μg/ml，自制膠體金檢測儀器檢出限達(dá)到0.16μg/ml。

圖5 SAA1的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 批內(nèi)和批間重復(fù)性測定

采用上述方法分別制備3批，每批次60個(gè)檢測用試紙條，每批試紙條檢測30份小牛血清陽性樣本（其中添加了0.8ng/ml SAA1標(biāo)準(zhǔn)品）和小牛血清陰性樣本。檢測結(jié)果如表1所示，陽性符合率與陰性符合率均為100%，說明SAA1膠體金試紙條檢測重復(fù)性良好。

表1 SAA1膠體金免疫試紙條批內(nèi)和批間重復(fù)性測定

2.5 方法學(xué)比對

采用市售標(biāo)準(zhǔn)Elisa檢測試劑盒與本文制備的膠體金免疫試機(jī)卡同時(shí)對45例患者血清和39例健康人血清中SAA1含量進(jìn)行測定，檢測結(jié)果如表2所示，兩種檢測方法的陽性結(jié)果符合率為97.8%（44/45），陰性結(jié)果符合率為100%（39/39）。

表2 兩種SAA1檢測方法對比

3 結(jié)論

該研究通過熱擊法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入至BL21大腸桿菌中，成功構(gòu)建了人血清淀粉樣蛋白A1重組表達(dá)工程菌pET-28a-SAA1（BL21）。

初步對目的基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果表明在總蛋白及可溶性蛋白液中均含有目的蛋白即重組人血清淀粉樣蛋白A1。通過實(shí)驗(yàn)獲得最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：溫度30℃，時(shí)間6h，轉(zhuǎn)速180rpm/min，培養(yǎng)基pH 7.0，IPTG濃度0.4mM。

同時(shí)，利用自制的基因重組SAA1蛋白，成功制備了人血清淀粉樣蛋白A1膠體金免疫層析試紙條，線性范圍0.16～500μg/ml，最低檢測限0.16μg/ml。并對試紙條的性能進(jìn)行研究，試紙條靈敏度高，特異性好，批間批內(nèi)的差異性小，穩(wěn)定性高，結(jié)合膠體金檢測儀器進(jìn)行檢測，制做出了檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，與市場免疫方法檢出限相當(dāng)。通過利用自制的檢測儀器配套使用，實(shí)現(xiàn)定量準(zhǔn)確快速檢測，可廣泛應(yīng)用于基層社區(qū)醫(yī)院和救災(zāi)現(xiàn)場，應(yīng)用前景廣闊。

［1］陳長強(qiáng)，顧志冬，樊綺詩.血清淀粉樣蛋白A在疾病應(yīng)用中的研究進(jìn)展［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27（9）：776-779.

［2］洪婭麗，雷長城.血清淀粉樣蛋白A與冠心病的研究進(jìn)展［J］.心斑管病學(xué)進(jìn)展，2007，28（1）：107-109．

［3］沈忱，暮云.血清淀粉樣蛋白A與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病活動的相關(guān)性研究［J］.天津醫(yī)藥，2014，42（3）：245-247.

［4］陳長強(qiáng)，楊晶，顧志冬，等.斑點(diǎn)免疫金滲濾法定量測定血清淀粉樣蛋白A方法的建立及性能評估［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，28（9）：835-840.

［5］Huttunen T，Te ppo A M，Lupisan Seta.Correlation betweenthes ever it yof infectious diseases in children and the ratio of serum amyloid A protein and C-reactive proten［J］.Scand J Infect Dis，2003，35（8）：488-490．

［6］UhlarCM，WhiteheadAS.SerumamyloidA，the major vertebrate acute·phase reactant［J］.Eur J Biochem，1999，265（2）：501-523.

［7］De Beer MC，Yuan T，Kindy MS，et a1.Characteri-ation of constitutive human serum amyloid A protein（SAA4）s an apolipoprotein［J］.J Lipid Res，1995，36（3）：526-534.

［8］Urieli-ShovalS，LinkeRP，MatznerY.Expression and function of serum amyloid A，a major acutephase protein，in normal and disease states［J］.Curt Opin Hematol，2000，7（1）：64-69.

［9］Hua S，Song C，Geczy CL，et a1.A role for acutephase serum amyloid A and high—density lipoprotein in oxidative stress，endothelial dysfunction and athero—sclerosis［J］.Redox Rep，2009，14（5）：187-196.

［10］Sandri S，Hatanaka E，F(xiàn)ranco AG，et a1.Serum amyloid A induces CCL20 secretion in mononuclear cells through MAPK（p38 and ERK1/2）signaling pathways［J］.Immunol Lett，2008，121（1）：22-26.

［11］Connolly M，Veale DJ，F(xiàn)earon U.Acute serum amyloidAregulatescytoskeletalrearrangement，cell matrix interactions and promotes cell migration in rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2011，70（7）：1296-1303.

［12］姜?jiǎng)ξ。瑮钣?，?yīng)春妹.乳膠增強(qiáng)免疫散射比濁法檢測血清淀粉樣蛋白A的應(yīng)用評價(jià)［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2015，30（1）：49-52.

［13］Wong R，Tse H.Lateral flow immunoassay［M］.Humana Pr Inc，2008.

Prokaryotic Expression and Colloidal Gold Detection Method of Human Serum Amyloid A1

SONG Yinglin1，ZHAO Yuhuan2，CHU Chunxu2，ZHANG Sichen2，ZHANG Xiao2
（1.Hospital of Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022；2.School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

To develop a specific，rapid，and convenient immune-chromatography assay（ICA）to quantitative detect the SAA1.Using Escherichia coli BL21（DE3）prokaryotic expression system of human serum amyloid A1（SAA1），according to BL21（DE3）gene fragment of Escherichia coli expressed preference for design and synthesis of SAA1 protein，the expression vector of pET-Pet28a-SAA1 was constructed，the preparation of Escherichia coli BL21 by CaCl2 method（DE3）electrocompeten，expression vector pET-28a-SAA1 into Escherichia coli BL21 by heat shock transformation method（DE3）.The optimization of expression conditions of recombinant protein，the optimal expression conditions：temperature 30，time 6h，medium speed 180r/min，pH 7，IPTG concentration of 0.4 mM，and then the expression of recombinant SAA1 protein after induced expression of protein，via using SDS-PAGE electrophoresis appraisal，Ni column purification，dialysis，and concentrated preparation for concentration of 8.09mg/ml，the purity of 85%SAA1 protein of high purity.At the same time，combining with colloidal gold marked technology，established the SAA1 colloidal gold immune chromatography test method，the linear is in the range of 0.16～500μg/ml，the minimum detection line 0.16μg/ml.The study provides a technical basis for the clinical diagnosis of SAA1 in vitro rapid detection and diagnosis.

human serum amyloid A1；prokaryotic expression；colloidal gold immuno chromatography；quantitative detection

R392

A

1672-9870（2016）06-0134-04

2016-08-02

宋英林（1963-），女，主任護(hù)師，E-mail：1013758138@qq.com

張曉（1979-），男，博士，副教授，E-mail：479336404@qq.com