黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的體外抑制

李程野，杜繼紅，廖慧芬，富冠豪，李梓銘

（廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州 510663）

黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的體外抑制

李程野，杜繼紅，廖慧芬，富冠豪，李梓銘

（廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州 510663）

本研究以具有抗炎抑菌、抗氧化、抗輻射和增強(qiáng)免疫能力等生理活性作用的植物次生代謝產(chǎn)物——黃酮類化合物作為抑菌劑，通過抑菌圈測(cè)定、最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）測(cè)定比較柚皮素、蘆丁、槲皮素三種黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌體外抑菌效果，為獲得新的食品防腐劑提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三種黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌均具有不同程度的抑制作用。抑菌強(qiáng)弱順序?yàn)殚纹に?、蘆丁、柚皮素。

黃酮類化合物；沙門氏菌；最小抑菌濃度；最小殺菌濃度

在各種的食物中毒中，沙門氏菌性食物中毒常居首位或第二位。沙門氏菌屬（Salmonella）為腸桿菌科的一個(gè)屬，廣泛分布于土壤、水、動(dòng)物糞便、動(dòng)物體等環(huán)境中，可通過各種途徑污染食品，如引起魚、肉類、蛋類腐敗，并使其表面變紅和變黏，導(dǎo)致食物中毒，并引發(fā)人類的傷寒、副傷寒等沙門氏菌病[1]。

沙門氏菌性食物中毒一般認(rèn)為是進(jìn)食大量活菌（105～109CFU/g）和毒素的協(xié)同作用所造成。潛伏期很短，活菌進(jìn)入腸道后繁殖，繼而侵襲腸黏膜及腸黏膜下層，引起發(fā)炎，水腫，充血和出血，可造成菌血癥和釋放內(nèi)毒素[2]。部分含VI抗原的細(xì)菌還能在吞噬細(xì)胞內(nèi)繁殖，據(jù)認(rèn)為VI抗原能防止細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的破壞。毒素包括內(nèi)毒素和腸毒素。內(nèi)毒素可引起發(fā)燒并增加消化道蠕動(dòng)而發(fā)生嘔吐和腹瀉。由于蠕動(dòng)加快，腸道內(nèi)致病菌被迅速排出體外，患者在短期內(nèi)多可恢復(fù)。腸道素能使細(xì)胞膜的腺苷酸環(huán)化酶活性增高，使細(xì)胞的氯離子分泌亢進(jìn)和對(duì)離子吸收的抑制，從而引起小腸過度分泌水分和電解質(zhì)，產(chǎn)生腹瀉，因此認(rèn)為腸毒素是導(dǎo)致腹瀉的因素。

沙門氏菌除甲、乙、丙型傷寒桿菌僅對(duì)人類致病外，多種菌是動(dòng)物和人類的共同致病菌；也有的對(duì)動(dòng)物是致病菌，對(duì)人類是條件致病菌。由感染沙門氏菌引起的疾病統(tǒng)稱沙門氏菌病，在人類主要為傷寒、副傷寒、食物中毒和敗血癥等[3]。潛伏期平均4～12 h，最短2 h，長(zhǎng)者達(dá)2～5 d。起病急，體溫可升高至38～40 ℃左右，伴嘔吐、腹痛、腹瀉（多為水樣便）等癥狀[4]。病情輕重程度不一，有時(shí)可出現(xiàn)傷寒或霍亂樣癥狀。一般病程短，預(yù)后較好，但嚴(yán)重者也可引起死亡。

黃酮類化合物（Flavonoid）是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類黃色色素。以C6-C3-C6為基本碳架，包括黃酮的同分異構(gòu)體及其氫化的還原產(chǎn)物。黃酮類化合物常應(yīng)用于植物研究領(lǐng)域，在植物體內(nèi)以苷類或碳糖基的形式存在，也有以游離形式存在的。天然黃酮類化合物母核上常含有羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基[5]。

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)類黃酮的研究集中在分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、清除自由基、藥理作用、抗輻射作用、抗癌和抗腫瘤等方面。與此同時(shí)，類黃酮對(duì)微生物的抑制和殺滅作用使類黃酮的研究進(jìn)入一個(gè)新的階段。國(guó)內(nèi)外對(duì)黃酮類化合物抑菌作用的研究，主要涉及抗菌能力的測(cè)定，具有抗菌能力的黃酮體種類和抑菌作用的構(gòu)效關(guān)系等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

（1）主要試驗(yàn)材料。槲皮素、蘆丁、柚皮素三種黃酮類化合物，由廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校食品化妝品教研組提供；沙門氏菌（Salmonella），由廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

（2）培養(yǎng)基。①固體培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2～7.4、121 ℃高壓滅菌30 min。②液體培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2～7.4、121 ℃高壓滅菌30 min。

（3）試驗(yàn)儀器。立式壓力蒸汽滅菌器YM型，上海三申醫(yī)療器械有限公司；生化培養(yǎng)箱LRH-500型，上海一恒科技有限公司；雙人凈化工作臺(tái)SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；電子恒溫水浴鍋HH-S28S型，江蘇金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；電子分析天平FA2204，上海上平儀器有限公司。試管、培養(yǎng)皿、吸管、酒精燈、接種環(huán)、三角瓶、燒杯、玻璃刮鏟、1 000 mL刻度搪瓷杯、小鋁鍋、托盤天平、分裝漏斗、漏斗架、紗布、棉塞、牛皮紙、橡皮圈、電爐。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）沙門氏菌的培養(yǎng)。配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基100 mL，從沙門氏菌菌種斜面挑取一環(huán)于盛有20 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放入生化培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)溫度為37 ℃，培養(yǎng)24 h后，再轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱冷藏保存，備用。

（2）黃酮類化合物溶液的配制。分別稱取100 mg槲皮素、蘆丁、柚皮素，溶解于10 mL無水乙醇中，配制成濃度為10.000 mg/mL的原液，備用。

（3）不同黃酮類化合物抑菌效果測(cè)試。利用瓊脂擴(kuò)散法，取濃度為106CFU/mL的沙門氏菌菌懸液1 mL，加入100 mL牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，吸取15 mL置無菌平皿制備含菌牛肉膏蛋白胨瓊脂平板，待凝固后，按梅花花瓣?duì)顚?只牛津杯放置于培養(yǎng)基平板表面，其中3杯分別加入濃度為10.000 mg/mL槲皮素、蘆丁、柚皮素溶液，用無水乙醇作為陰性對(duì)照，用慶大霉素針劑作為陽(yáng)性對(duì)照，每組分別設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。然后再將平皿置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h后取出觀察[6]。用游標(biāo)卡尺測(cè)量形成的抑菌圈直徑并比較其抑菌效果。每種抑菌液的排列如圖1所示。

圖1 各種抑菌液的排列方式圖

（4）不同黃酮類化合物最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定。配制不同濃度的黃酮類化合物，采用試管2倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）。試驗(yàn)中每種制劑原液（10.000 mg/mL）均用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2倍系列稀釋10個(gè)梯度，每組13支試管，各試管中加入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2.5 mL，在第1管內(nèi)各加入槲皮素、蘆丁、柚皮素2.5 mL，混勻后吸取2.5 mL到第2管，混勻后吸取2.5 mL到第3管，依次類推到第10管，每管黃酮類物質(zhì)濃度見表1。第11支試管作陽(yáng)性對(duì)照（慶大霉素），第12、13支管作陰性對(duì)照（生理鹽水、無水乙醇）[7]。

表1 含不同濃度黃酮類化合物的液體試管培養(yǎng)基的配制表

每組試管中分別接種沙門氏桿菌菌懸液0.05 mL，并將上述試管置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，取出試管，充分震蕩后根據(jù)其渾濁度，判斷有無菌生長(zhǎng)。如試管中培養(yǎng)液出現(xiàn)膜狀物或混濁為“+”，無膜狀物且澄清透明為“-”，表明沙門氏菌的生長(zhǎng)被抑制[8]。若上述試管用難以肉眼判斷其混濁度，則分別接種到對(duì)應(yīng)編號(hào)的斜面培養(yǎng)基上，置于相應(yīng)溫度培養(yǎng)，觀察沙門氏菌的生長(zhǎng)情況[9]。導(dǎo)致沙門氏菌完全被抑制的最低黃酮類化合物濃度即為其對(duì)相應(yīng)菌株的MIC[10]。

（5）不同黃酮類化合物最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定。取上述物最小抑菌濃度以上未見細(xì)菌生長(zhǎng)的各管培養(yǎng)物，分別吸取100 μl，涂布接種在不含制劑的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上[11]，置37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察有無菌生長(zhǎng)，計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落者即為該黃酮類化合物的最低殺菌濃度（MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的作用

利用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)沙門氏菌的測(cè)定結(jié)果見表2。從表2可知，三種黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的抑菌效果各不相同，槲皮素對(duì)沙門氏菌的抑菌作用最強(qiáng)，蘆丁對(duì)沙門氏菌的抑菌作用次之，柚皮素對(duì)沙門氏菌的抑菌作用最低。三種黃酮類化合物抑制沙門氏菌能力大小順序?yàn)殚纹に兀咎J丁＞柚皮素。

表2 黃酮類化合物抑制沙門氏菌活性表

2.2 不同黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的抑菌效果

不同濃度的黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的抑菌效果見表3。從表3可知，在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，三種黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌具有不同程度的抑制作用，且各自隨著濃度的增加，抑菌作用增強(qiáng)；其中槲皮素的抑菌效果最為明顯；蘆丁次之；與之相比柚皮素的抑菌濃度最高，需要在較高濃度才能完全抑制沙門氏菌的生長(zhǎng)。

表3 不同濃度的黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的抑菌效果表

2.3 不同黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度（MIC）

黃酮類化合物的最小抑菌濃度見表4。由表4可知，三種黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌均有不同程度的抑菌作用，柚皮素的最低抑菌濃度最高，其次是蘆丁，槲皮素的抑菌濃度最低，即抑制沙門氏菌的作用最強(qiáng)。

表4 黃酮類化合物的最小抑菌濃度表

2.4 不同黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的殺菌效果

不同濃度的黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的殺菌效果見表5。由表5可知，在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，三種黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌具有不同程度的殺菌作用，且各自隨著濃度的增加，殺菌作用增強(qiáng)。其中槲皮素的殺菌效果最為明顯，蘆丁和柚皮素殺菌效果次之。

表5 不同濃度的黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的殺菌效果表

2.5 不同黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌的最低殺菌濃度（MBC）

黃酮類化合物的最低殺菌濃度見表6。由表6可知，三種黃酮類化合物對(duì)沙門氏菌能在較低的濃度下殺菌，柚皮素稍高，蘆丁和槲皮素的殺菌濃度次之，且隨著濃度的增加，殺菌作用越強(qiáng)。

表6 黃酮類化合物的最低殺菌濃度表

3 結(jié)語

從抑菌圈試驗(yàn)、最小抑菌濃度試驗(yàn)和最低殺菌試驗(yàn)可得出，柚皮素、蘆丁、槲皮素三種黃酮類化合物，特別是槲皮素，能夠在很低的濃度下抑制沙門氏菌的生長(zhǎng)?？傮w抑菌效果上，三種黃酮類化合物抑制沙門氏菌能力大小順序槲皮素＞蘆?。捐制に?，且在濃度高時(shí)具有殺菌的作用，黃酮類化合物柚皮素、蘆丁、槲皮素對(duì)沙門氏菌的最低殺菌濃度分別為0.063、0.125、0.125 mg/mL，且隨著濃度的增加，殺菌作用越強(qiáng)。說明這三種黃酮類化合物柚皮素、蘆丁、槲皮素具有開發(fā)利用價(jià)值。

目前，黃酮類化合物對(duì)微生物的抗菌活性的研究基本集中于體外試驗(yàn)。黃酮類化合物在人和動(dòng)物體內(nèi)，尤其是消化道內(nèi)對(duì)微生物活性影響的研究極少，有待進(jìn)一步深入研究[12]。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB4789.31-2013 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗(yàn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[2]趙 貴，張 華.畜產(chǎn)品中沙門氏菌的危害及檢驗(yàn)方法概述[J]，貴州畜牧獸醫(yī)，2004，28（3）：21-22.

[3]郭成東，張?jiān)词?，王?guó)杰，等.伴大豆球蛋白及其水解肽對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)的影響[J].食品科學(xué)，2009（17）：30-34.

[4]王章云，滕煥昭.沙門氏菌引起的食物中毒細(xì)菌學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)人畜共患病學(xué)報(bào)，1999（3）：115.

[5]賀奮義.沙門氏菌的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2006（11）：91-95.

[6]李 楊，鞠玉琳，王曉波，等.中藥連黃對(duì)耐藥沙門氏菌抑制作用的研究[J]，吉林畜牧獸醫(yī)，2007（9）：9-11.

[7]張艷紅，吳延功，杜元釗，等.沙門氏菌快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2001（2）：41-43,50.

[8]謝 鵬，張敏紅.黃酮類化合物抑菌作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物保健，2004（12）：35-37.

[9]曾曉芳.畜產(chǎn)品中沙門氏菌污染的檢測(cè)與控制[J].四川畜牧獸醫(yī)，2003（4）：28-29.

[10]羅雪云等.食品衛(wèi)生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

[11]杜 林，黃小丹，趙文紅，等.MIC法測(cè)定四種抗氧化劑的抑菌作用[J].中國(guó)調(diào)味品，2006（8）：40-44.

[12]方從兵，宛曉春，江昌俊.黃酮類化合物生物合成的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（4）：498-504.

Flavonoids Compounds to Salmonella in Vitro Inhibition

Li Chengye, Du Jihong, Liao Huifen, Fu Guanhao, Li Ziming
(Guangdong Food and Drug Vocational-technical School, Guangzhou 510663, China)

This paper focuses on plant secondary metabolites flavonoids which has the activity of anti-inflammatory antibacterial, antioxidation, radiation and enhance immune physiological. Through the Bacteriostatic circle determination, MIC and MBC determine comparative three kinds of flavonoids compounds, naringenin, rutin and quercetin for Salmonella in vitro antibacterial effect, to obtain the new food preservatives, provides the basis. According to the results, three kinds of flavonoids have different degrees of inhibition Salmonella. Antimicrobial activity is quercetin＞rutin＞naringenin.

Flavonoids; Salmonella; MIC; MBC

R378.2+2

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.22.044

李梓銘