不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的分離鑒定及其群落結(jié)構(gòu)的變化

聶遠(yuǎn)洋，鄧 岳，劉戎梅，官久強(qiáng)，羅曉林，孫 群

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；2.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 瀘州 646000；3.四川省草原科學(xué)研究院，四川 成都 611731）

不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的分離鑒定及其群落結(jié)構(gòu)的變化

聶遠(yuǎn)洋1，鄧 岳2，劉戎梅1，官久強(qiáng)3，羅曉林3，孫 群1

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；2.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 瀘州 646000；3.四川省草原科學(xué)研究院，四川 成都 611731）

為了解麥洼牦牛腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和功能及其動(dòng)態(tài)變化過程，同時(shí)獲得具有潛在益生菌活性和應(yīng)用可能性的腸道菌株，采用不同的培養(yǎng)基在不同的培養(yǎng)條件下分離麥洼牦牛腸道細(xì)菌并進(jìn)行16S rDNA分子鑒定，同時(shí)采用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)分析不同年齡麥洼牦牛腸道細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和功能及其差異。結(jié)果表明，從不同年齡麥洼牦牛大腸內(nèi)容物中共分離到90株細(xì)菌，其中3株歸為放線菌門（Actinobacteria），64株為厚壁菌門（Firmicutes），23株為變形菌門（Proteobacteria）；分離到的34株芽孢桿菌屬（Bacillus）和14株乳酸桿菌屬（Lactobacillus）細(xì)菌具有潛在益生菌活性，可作為微生物飼料添加劑補(bǔ)飼麥洼牦牛；對(duì)DGGE圖譜的UPGMA聚類、PCA和多樣性指數(shù)分析顯示，不同年齡的麥洼牦牛腸道細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)有差異，相同年齡的個(gè)體相似度較高，而不同年齡的個(gè)體相似度較小，較大年齡（2.5和3.5歲）的牦牛腸道菌群多樣性大于較小年齡個(gè)體（0.5和1.5歲），且分布更均勻，腸道菌群隨宿主年齡變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化并趨于穩(wěn)定的過程；DGGE條帶的物種鑒定結(jié)果表明，大部分條帶為未（能）培養(yǎng)細(xì)菌，PCR-DGGE與分離培養(yǎng)法結(jié)合可以很好地表征麥洼牦牛腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能。

腸道菌群；牦牛；培養(yǎng)法；16S rDNA；PCR-DGGE

0 引 言

牦牛（Yak，Bos grunniens）是高寒地區(qū)的特有牛種，草食性反芻家畜，也是我國(guó)的主要牛種之一，主要產(chǎn)于青藏高原海拔3000m以上地區(qū)。麥洼牦牛是在川西北高寒生態(tài)條件下經(jīng)長(zhǎng)期自然選擇和人工選擇形成的乳、肉性能良好的草地型牦牛品種，對(duì)高寒草地特別是沼澤草地有良好的適應(yīng)性，是四川省群體數(shù)量最大的牦牛地方品種[1]。牦牛具有奶、肉、絨、皮等多種經(jīng)濟(jì)用途，且具有風(fēng)味獨(dú)特、品質(zhì)優(yōu)良的奶和肉，來自高原地區(qū)的牦牛產(chǎn)品正以其無污染的特色野味逐漸受到人們的青睞[2]。

牦牛的腸道是其消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所，直接關(guān)系到牦牛的營(yíng)養(yǎng)與健康。其腸道內(nèi)共生著大量細(xì)菌，能進(jìn)一步分解食物殘?jiān)椭参锢w維，促進(jìn)牦牛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[3]。腸道正常菌群在一般情況下不會(huì)致病，一些腸道細(xì)菌還能利用腸道內(nèi)簡(jiǎn)單的物質(zhì)合成維生素B和維生素K等；但由于牦牛的主產(chǎn)區(qū)青藏高原海拔較高、氣候嚴(yán)寒惡劣、冷季草料匱乏，易導(dǎo)致牦牛掉膘、生病和死亡等冷季損失問題，因此深入了解牦牛腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)對(duì)牦牛的營(yíng)養(yǎng)具有十分重要的意義。目前關(guān)于系統(tǒng)深入地研究牦牛腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能，以及它們的動(dòng)態(tài)變化和與牦牛營(yíng)養(yǎng)代謝的潛在關(guān)聯(lián)還鮮見報(bào)道，少量的研究大都集中于其腸道微生物的分離培養(yǎng)鑒定，且與疾病的防控相關(guān)[4-5]。

傳統(tǒng)培養(yǎng)法存在只能反映少數(shù)微生物的信息、檢測(cè)結(jié)果誤差較大、易漏掉具有應(yīng)用價(jià)值的微生物資源等問題[6]，但這種方法在分離具有一定特殊功能的目標(biāo)微生物時(shí)非常有用，許多微生物資源的開發(fā)與利用還是要依賴傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)[5，7]。PCRDGGE指紋圖譜技術(shù)在研究復(fù)雜微生物區(qū)系的遺傳多樣性和種群差異等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前已成為分析微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化廣泛采用的技術(shù)[8]。而隨著大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，宏基因組學(xué)（Metagenomics）以環(huán)境中未培養(yǎng)微生物為研究對(duì)象，近年來在微生物生態(tài)學(xué)和環(huán)境微生物學(xué)研究中得到了快速的發(fā)展[9-10]，這一技術(shù)在揭示未發(fā)現(xiàn)的物種存在，以及鑒定微生物組的部分基因功能和不同微生物的基因功能差異等方面具有更加強(qiáng)大的功能，因此也成為目前腸道微生物研究重點(diǎn)采用的技術(shù)[11]。本研究采用不同的培養(yǎng)基在不同的培養(yǎng)條件下分離麥洼牦牛腸道細(xì)菌并進(jìn)行16S rDNA分子鑒定，分析討論獲得的菌株的益生菌活性和應(yīng)用可能性；同時(shí)采用PCR-DGGE技術(shù)分析不同年齡麥洼牦牛腸道細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和功能及其差異，分析并討論腸道菌群隨宿主年齡的動(dòng)態(tài)變化過程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京天根公司；Stool DNA Kit，Gel Extraction Kit，美國(guó)OMEGA公司；日本Takara公司；SYBR Green I核酸染料，美國(guó)Sigma公司；LB培養(yǎng)基（LB）、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）和厭氧瓊脂培養(yǎng)基（SAA），青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器

S1000TMPCR儀，WIDE型電泳槽，PowerPacTMBasic型電泳儀，UniversalHood II型凝膠成像系統(tǒng)，DCodeTMUniversal Mutation Detection System，美國(guó)Bio-Rad公司；LEGEND MICRO 21R型高速冷凍離心機(jī)，1389型生物安全柜（A2），美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；AFZ-1002-U型超純水儀，艾科浦公司；厭氧密封培養(yǎng)罐（2.5L和7.0L），日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

所有麥洼牦牛腸道內(nèi)容物樣品采自四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣肉聯(lián)廠，各年齡階段（0.5，1.5，2.5，3.5歲）的麥洼牦牛均由四川省草原科學(xué)研究院規(guī)范化養(yǎng)殖，在屠宰時(shí)剪取牦牛的大腸（含內(nèi)容物）并分別冷藏保存，用于分離微需氧菌和完全厭氧菌的樣品則迅速放入?yún)捬趺芊夤蓿ǚ謩e含微氧產(chǎn)氣袋和完全厭氧產(chǎn)氣袋）中冷藏保存。分別取到各年齡階段的麥洼牦牛腸道內(nèi)容物樣品各5份。

1.2.2 菌株分離純化

取麥洼牦牛腸道內(nèi)容物用無菌水分散后涂布于新鮮制備的LB培養(yǎng)基平板和腦心浸液肉湯培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d，待長(zhǎng)出單菌落后用接種環(huán)挑取單菌落劃線轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)基平板和腦心浸液肉湯培養(yǎng)基平板上，按前述方法培養(yǎng)1～2d，如此反復(fù)挑取單菌落純化至得到純培養(yǎng)，并分別甘油保藏和真空冷凍干燥保藏菌種。

取用于分離微需氧菌和完全厭氧菌的樣品用無菌水分散后分別涂布于新鮮制備的厭氧瓊脂培養(yǎng)基平板上，迅速置于厭氧培養(yǎng)盒中，向盒子的水槽中倒入少量無菌水，然后分別放入微氧產(chǎn)氣包（5%氧氣殘留）和完全厭氧產(chǎn)氣包（無氧氣殘留），迅速蓋上盒子的密封蓋，將厭氧盒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7d，待長(zhǎng)出單菌落后用接種環(huán)挑取單菌落劃線轉(zhuǎn)接至新鮮的厭氧瓊脂培養(yǎng)基平板上，按前述方法培養(yǎng)5～7d，如此反復(fù)挑取單菌落純化至得到純培養(yǎng)，并分別甘油保藏和真空冷凍干燥保藏菌種。

1.2.3 基因組DNA提取

采用TIANGEN公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離純化的細(xì)菌基因組DNA，采用OMEGA公司Stool DNA Kit試劑盒提取麥洼牦牛腸道內(nèi)容物樣品的總基因組DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取結(jié)果。

1.2.4 16S rDNA擴(kuò)增和膠回收

PCR引物序列[8]為：27F 5′-AGAGTTTGATCMTG GCTCAG-3′，1492R 5′-TACGGYTACCTTGTTACGA CTT-3′。50 μL體系：4 μL模板DNA，上下游引物各2μL，25μL 2×Taq PCR MasterMix（Loading dye mix），17 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃，30 s，58℃，45s，72℃，90s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃，延伸7min。陰性對(duì)照用ddH2O作為模板。擴(kuò)增結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并進(jìn)行結(jié)果分析。采用OMEGA公司的Gel Extraction Kit回收瓊脂糖凝膠中的16S rDNA，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收結(jié)果。

PCR引物序列[8]為：HDA1-GC 5′-CGCCCGGGG CGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACT CCTACGGGAGGCAGCAGT-3′，HDA2 5′-GTATTAC CGCGGCTGCTGGCAC-3′。50 μL體系：4 μL模板DNA（膠回收后的腸道內(nèi)容物總基因組DNA的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物），上下游引物各2 μL，25 μL 2×Taq PCR MasterMix（Loading dye mix），17μL ddH2O。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃，30s，53℃，30s，68℃，30s，30個(gè)循環(huán)；最后68℃，延伸7min。陰性對(duì)照用ddH2O作為模板。擴(kuò)增結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.6 DGGE

制備8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度濃度為35%～65%，呈線性增加，梯度方向與電泳方向平行，加入20μL含有適量上樣緩沖液的16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳時(shí)，溫度為60℃，電壓為120V，運(yùn)行6h。電泳后用SYBR Green I進(jìn)行染色，染料用1×TAE以1∶10 000稀釋，每次染液用量15 mL，染色15min，共染3次。染色完后用凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并用Quantity One 4.6.9軟件分析結(jié)果。

1.2.7 物種鑒定

將膠回收后的各分離菌株的16S rDNA送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序，獲得的序列分別在NCBI BLAST上比對(duì)并分析結(jié)果。將DGGE凝膠上的特征條帶切下，加入50～100 μL ddH2O，在4℃冰箱放置過夜，使膠條中的DNA釋放出來，以此為模板，用不含GC夾子的V3區(qū)引物擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件同前1.2.5，擴(kuò)增產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序，將獲得的序列在NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫中比對(duì)后獲得物種信息。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用Quantity One 4.6.9軟件將DGGE圖譜的DNA條帶亮度數(shù)字化，根據(jù)香農(nóng)指數(shù)（H′）、豐富度（S）和均勻度（EH）的計(jì)算公式分別計(jì)算得到麥洼牦牛腸道菌群的香農(nóng)指數(shù)、豐富度和均勻度，以分析各樣品中細(xì)菌的種群多樣性及分布的均勻性。各指數(shù)的計(jì)算式如下式所示：

式中：Pi——某一條帶的亮度與同泳道中所有條帶總亮度的比值；

整個(gè)一體化五防系統(tǒng)內(nèi)所有五防主/子站、電腦鑰匙均具備黑匣子功能，即：系統(tǒng)對(duì)全時(shí)段所有倒閘操作情況進(jìn)行記錄，包括各操作任務(wù)的已/未執(zhí)行項(xiàng)及時(shí)間、異常操作等詳細(xì)信息；并可按操作類型、電壓等級(jí)、操作時(shí)間等任意定制關(guān)鍵字對(duì)記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行查尋、調(diào)閱；記錄在電腦鑰匙中的信息可調(diào)閱但無法刪除；最大記錄項(xiàng)數(shù)2000項(xiàng)，掉電記憶達(dá)5年。系統(tǒng)提供將所需數(shù)據(jù)根據(jù)可調(diào)模板制作電子數(shù)據(jù)并打印。

S——每一泳道中總的條帶數(shù)目。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件的One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，并用LSD法和Dunnett’s T3法進(jìn)行事后兩兩比較分析。采用Canoco for Windows 4.5軟件進(jìn)行PCA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥洼牦牛腸道細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果

采用LB和BHI培養(yǎng)基分離需氧菌，采用SAA培養(yǎng)基分別在微氧（5%氧氣）和無氧條件下分離微需氧菌和厭氧菌，分離菌株的鑒定結(jié)果和分類見表1。從不同年齡麥洼牦牛大腸內(nèi)容物中共分離到90株細(xì)菌，主要?dú)w為放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其中絕大多數(shù)菌株屬于厚壁菌門（64株）和變形菌門（23株）細(xì)菌，放線菌門細(xì)菌僅有3株，而擬桿菌門（Bac teroidetes）細(xì)菌則未分離到。在屬的水平上，85%以上的菌株歸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）這4個(gè)屬，分別有34，20，14，10株細(xì)菌。從分離培養(yǎng)條件來看，得到的需氧菌數(shù)量（57株）要遠(yuǎn)高于微需氧菌（12株）和厭氧菌（21株）。

表1 基于16S rRNA基因序列比對(duì)后的麥洼牦牛腸道菌株親緣關(guān)系分類1）

2.2 麥洼牦牛腸道菌群16S rDNA V3區(qū)DGGE圖譜

不同年齡（0.5，1.5，2.5，3.5歲）麥洼牦牛腸道菌群的DGGE圖譜如圖1所示，圖中各泳道的條帶數(shù)量和亮度的差異反映了各樣品中腸道細(xì)菌種群多樣性和含量的差異?？傮w來看，在條帶數(shù)量上2.5和3.5歲麥洼牦牛最多，其次是1.5歲，而0.5歲最少，表明4個(gè)不同年齡階段的麥洼牦牛其腸道細(xì)菌種群多樣性存在一定的差異；在特征優(yōu)勢(shì)條帶上0.5和1.5歲麥洼牦牛明顯多于2.5歲，也就是說0.5和1.5歲麥洼牦牛含有更多豐度較高的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群，而2.5和3.5歲麥洼牦牛腸道菌群的分布較為均一，表明麥洼牦牛在生長(zhǎng)過程中腸道菌群的多樣性及分布趨于穩(wěn)定和均一。

2.3 UPGMA聚類分析和PCA分析

采用Quantity One 4.6.9軟件的UPGMA算法對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析，以了解不同年齡麥洼牦牛腸道細(xì)菌物種類型和豐度在總體水平上相似度的差異，聚類結(jié)果如圖2（a）所示。從圖中可以看出，同一年齡的麥洼牦牛在腸道細(xì)菌物種類型和豐度的總體水平上最先聚為一類，且相似值達(dá)到0.70以上，說明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較小，而不同年齡麥洼牦牛的聚類距離最遠(yuǎn)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。采用Quantity One 4.6.9軟件將DGGE圖譜的每一個(gè)泳道（樣品）的每一個(gè)條帶的亮度轉(zhuǎn)換為數(shù)值，并用Canoco for Windows 4.5軟件進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖2（b）所示。從圖中可以看出，同組樣品間距離較小，能大致聚在一起，而不同組間則距離較遠(yuǎn)，0.5和1.5歲兩組間的個(gè)體樣本距離較近，而與2.5和3.5歲組內(nèi)個(gè)體樣本距離都較遠(yuǎn)，與DGGE圖譜和UPGMA聚類分析結(jié)果一致。

圖1 麥洼牦牛腸道菌群16S rDNA V3區(qū)DGGE圖譜

圖2 不同年齡麥洼牦牛腸道菌群DGGE圖譜的UPGMA聚類分析和PCA分析

2.4 不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的多樣性指數(shù)分析

分別計(jì)算得到不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的香農(nóng)指數(shù)（H′）、豐富度（S）和均勻度（EH），以分析各樣品中細(xì)菌種群多樣性及分布的均勻性，結(jié)果如表2所示。從表中可以看出3.5和2.5歲麥洼牦牛腸道菌群的香農(nóng)指數(shù)、豐富度和均勻度均顯著性高于1.5和0.5歲（P＜0.05），表明不同年齡階段的麥洼牦牛腸道細(xì)菌種群多樣性和分布均一性存在顯著性差異，與直觀的DGGE圖譜分析結(jié)果一致；而0.5和1.5歲麥洼牦牛腸道菌群的香農(nóng)指數(shù)、豐富度和均勻度則沒有顯著性差異（P＞0.05）；2.5和3.5歲麥洼牦牛腸道菌群的香農(nóng)指數(shù)、豐富度和均勻度也沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表2 不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的香農(nóng)指數(shù)、豐富度和均勻度顯著性差異分析（N=5）1）

2.5 麥洼牦牛腸道菌群DGGE圖譜的特征條帶回收及物種鑒定

從不同年齡麥洼牦牛腸道菌群DGGE圖譜中切膠回收了42個(gè)特征條帶，通過PCR擴(kuò)增、膠回收、測(cè)序和NCBI BLAST序列比對(duì)后得到各條帶代表的物種信息，如表3所示。麥洼牦牛腸道菌群絕大部分為未（能）培養(yǎng)細(xì)菌，其中相對(duì)豐度較多的主要有梭菌屬（Clostridium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）的細(xì)菌，這些細(xì)菌也主要存在于幼年時(shí)期（0.5和1.5歲）麥洼牦牛的腸道中，它們構(gòu)成了幼年麥洼牦牛的腸道優(yōu)勢(shì)菌群。而隨著麥洼牦牛的成長(zhǎng)（2.5和3.5歲），這些優(yōu)勢(shì)菌群的豐度逐漸減少，另外一些新的菌屬的細(xì)菌被檢測(cè)到，如微桿菌屬（Microbacterium）、疣微菌屬（Verrucomicrobia）、放線菌屬（Actinobacterium）、Akkermansia sp.、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、優(yōu)桿菌科（Eubacteriaceae）、綠彎菌綱（Chloroflexi）等細(xì)菌，這些細(xì)菌也是麥洼牦牛腸道中的正常菌群，它們?cè)黾恿似渌拗髂c道菌群的多樣性和均勻性，更有助于成年（＞2歲）麥洼牦牛對(duì)草料類食物的消化和營(yíng)養(yǎng)的吸收。

表3 麥洼牦牛腸道菌群DGGE圖譜的特征條帶序列比對(duì)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 麥洼牦牛腸道菌群中的潛在益生菌資源

本研究中采用不同培養(yǎng)基和不同的培養(yǎng)條件從麥洼牦牛大腸內(nèi)容物中分離可培養(yǎng)細(xì)菌，其中分離到的最多的是芽孢桿菌屬（Bacillus）的細(xì)菌，共有34株，常見的有枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌、簡(jiǎn)單芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌等。我國(guó)于1994年法定乳酸桿菌、芽孢桿菌、糞鏈球菌、酵母菌和雙歧桿菌等是可用于微生態(tài)制劑生產(chǎn)的主要菌種[12]。因?yàn)檠挎邨U菌的芽孢可耐長(zhǎng)期貯存，所以一般將芽孢作為益生菌產(chǎn)品開發(fā)生產(chǎn)，常用于飼料添加劑的芽孢桿菌屬的細(xì)菌主要有枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌等[13]。乳酸桿菌是其作為微生物飼料添加劑而研究最多且應(yīng)用最廣泛的一類益生菌[14]，其在動(dòng)物腸道內(nèi)繁殖屬于正常菌種，而且可產(chǎn)生多種抑制性化合物和對(duì)抗性物質(zhì)以及有機(jī)酸等，這些有機(jī)酸本身就是動(dòng)物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還能降低腸道內(nèi)的pH值，從而抑制其他致病菌和腐敗菌的增殖。因此，本研究中分離到的大量芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬的細(xì)菌可在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)其益生菌活性和安全性，并作為益生菌劑直接補(bǔ)飼麥洼牦?；蛘咛砑拥角噘A飼草中再補(bǔ)飼麥洼牦牛，以提高其生產(chǎn)性能和減少在冷季的損失。

當(dāng)然，培養(yǎng)法中所使用的分離培養(yǎng)基的種類及其營(yíng)養(yǎng)成分的豐富程度也對(duì)分離到的細(xì)菌種類和數(shù)量有直接的影響，比如本研究中所使用的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基，其營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)豐富，因此相對(duì)另外兩種培養(yǎng)基而言，其分離到的菌群種類和數(shù)量都最多。但是動(dòng)物腸道的可培養(yǎng)微生物畢竟只占很小的一部分，要了解麥洼牦牛整個(gè)腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能，還需要其他分子生物學(xué)的非培養(yǎng)法的結(jié)合研究，而DGGE條帶的鑒定結(jié)果表明大部分的條帶為未（能）培養(yǎng)細(xì)菌，因此兩種方法結(jié)合可更加全面地了解麥洼牦牛腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能。

3.2 不同年齡麥洼牦牛腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化

對(duì)DGGE圖譜中不同樣本的UPGMA聚類、PCA和多樣性指數(shù)分析，結(jié)果表明不同年齡的麥洼牦牛其腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)都有一定的差異，表現(xiàn)為相同年齡的個(gè)體相似度較高，聚類和PCA結(jié)果也聚為一類，而不同年齡間的個(gè)體相似度較小，聚類和PCA距離較遠(yuǎn)；在多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)、豐富度和均勻度）的差異上，0.5和1.5歲之間無顯著性差異，2.5和3.5歲之間也無顯著性差異，而較大年齡組（2.5和3.5歲）顯著性高于較小年齡組（0.5和1.5歲），表明較大年齡的麥洼牦牛其腸道菌群的多樣性大于較小年齡個(gè)體，且分布更均勻，腸道菌群隨宿主的年齡變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化并趨于穩(wěn)定的過程。分析其原因可能是食物的影響，動(dòng)物從出生到成年其腸道菌群是一個(gè)從不斷定植到逐漸穩(wěn)定的過程[15]，麥洼牦牛在較小年齡時(shí)未完全斷奶，奶和草同時(shí)進(jìn)食，而成年后（一般2歲左右）只食草料，腸道菌群也已完成定植，因此表現(xiàn)為更高的多樣性和均勻性。

4 結(jié)束語

腸道菌群可以受到來自宿主方面的很多影響，如食物、年齡、抗生素的使用情況、健康狀況等，同時(shí)也可以受很多環(huán)境因子的影響，如生活地域、季節(jié)和飼養(yǎng)條件等[8]。本研究采用PCR-DGGE技術(shù)分析了不同年齡麥洼牦牛腸道細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及其差異，證實(shí)了麥洼牦牛腸道菌群隨宿主的年齡變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化并趨于穩(wěn)定的過程，表現(xiàn)為成年麥洼牦牛的腸道菌群具有更高的多樣性和均勻性。并采用不同的培養(yǎng)基在不同的培養(yǎng)條件下分離到90株麥洼牦牛腸道細(xì)菌，其中34株芽孢桿菌屬和14株乳酸桿菌屬細(xì)菌具有潛在益生菌活性，經(jīng)驗(yàn)證后可作為微生物飼料添加劑用于補(bǔ)飼麥洼牦牛，以提高其生產(chǎn)性能和減少在冷季的損失。

[1]黃彩霞，高媛，孫寶忠，等.牦牛品種品質(zhì)研究進(jìn)展[J].肉類研究，2012，26（9）：30-34.

[2]徐培倫，張正萍，彭宇鴻，等.麥洼牦牛肉品質(zhì)相關(guān)特性研究[J].四川動(dòng)物，2015，34（5）：759-763.

[3]左愈臻，高世杰，邵建華，等.成年牦牛小腸結(jié)構(gòu)及黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量變化研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42（12）：1776-1781.

[4]任麗倩，于學(xué)輝，宋定州，等.牦牛大腸桿菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39（1）：168-172.

[5]董映輝，張朝輝，毛全富，等.甘孜州牦牛沙門氏菌的分離和鑒定[J].四川畜牧獸醫(yī)，2011，244（2）：27-29.

[6]BLAUT M. Ecology and physiology of the intestinal tract[M].Berlin：Springer，2011：247-272.

[7]張貝貝，趙曉兵，何麗麗，等.牛瘤胃細(xì)菌產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（4）：128-132.

[8]LI M J，ZHOU M，ADAMOWICZ E，et al.Characterization of bovine ruminal epithelial bacterial communities using 16S rRNA sequencing，PCR-DGGE，and qRT-PCR analysis[J].Veterinary Microbiology，2012，155（1）：72-80.

[9]劉海燕，常玉梅.宏基因組學(xué)及在人體微生物研究上的應(yīng)用[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（8）：51-54.

[10]MACKELPRANG R，WALDROP M P，DEANGELIS K M，et al.Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw[J].Nature，2011，480（7377）：368-371.

[11]QIN J J，LI Y R，CAI Z M，et al.A metagenomewide association study of gut microbiota in type 2 diabetes[J].Nature，2012，490（7418）：55-60.

[12]徐鵬，董曉芳，佟建明.微生物飼料添加劑的主要功能及其研究進(jìn)展[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，24（8）：1397-1403.

[13]刁其玉.微生物制劑在幼齡反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料中的應(yīng)用[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26（10）：3159-3167.

[14]丁軻，余祖華，程相朝，等.高產(chǎn)纖維素酶益生乳酸桿菌的分離鑒定[J].飼料與畜牧：新飼料，2010（11）：37-40.

[15]ZHAO W，WANG Y，LIU S，et al.The dynamic distribution of porcine microbiota across different ages and gastrointestinal tract segments[J].Plos One，2015，10（2）：117-441.

（編輯：莫婕）

Isolation and identification of gut microbiota with community structure changes in different ages of Maiwa yaks

NIE Yuanyang1，DENG Yue2，LIU Rongmei1，GUAN Jiuqiang3，LUO Xiaolin3，SUN Qun1
（1.Key Laboratory of Bio-resource and Bio-environment，College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China；2.Luzhou Vocational and Technical College，Luzhou 646000，China；3.Sichuan Grassland Science Academy，Chengdu 611731，China）

To understand the community structure composition，functions and dynamic changes of Maiwa yaks’gut microbiota and obtain the gut bacterial strain of Maiwa yaks with Potential probiotic activity and application possibility，different culture mediums were used to separate the intestinal bacteria of Maiwa yaks under different culture conditions，and 16S rDNA molecular identification was also carried out.In the meantime，denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）technology was also applied to analyze the community structure and function and the difference of intestinal bacteria of Maiwa yaks at different ages.The results showed that totally 90 strains of bacteria were separated from the gut content of Maiwa yaks at different ages，in which 3，64，and 23 strains were classified as the phylum ofActinobacteria， Firmicutes and Proteobacteria respectively.Totally 34 strains of the genus Bacillus and 14 strains of the genus Lactobacillusbacteria with potential probiotic activity were also separated，and they can be used as microbial feed additives to Maiwa yak supplementary feeding.Analysis of UPGMA clustering，PCA，and diversity index of DGGE spectrum indicated that the community structure of gut microbiota at different ages is different，and the similarity between animals of the same ages is high，while the similarity between different ages of animals is low.The diversity of gut microbiota of elder groups of Maiwa yaks(2.5 and 3.5 years)is significantly higher than that of younger groups(0.5 and 1.5 years)but with more homogeneous distribution，which indicates that the change of gut microbiota along with the age change of host is a dynamic process tending to be stable.Species identification results of DGGE bands showed that most of the bands were uncultured bacteria，further indicating that the method of combining PCR-DGGE with plate-culture method can be a more comprehensive way to characterize the structure and function of gut microbiota of Maiwa yaks.

gut microbiota；yak；culture-dependent method；16S rDNA；PCR-DGGE

A

：1674-5124（2016）12-0053-07

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.12.012

2016-08-09；

：2016-09-21

四川省科技支撐計(jì)劃課題（2016NZ0005）

聶遠(yuǎn)洋（1986-），男，重慶市人，博士，研究方向?yàn)橘Y源微生物。

孫 群（1967-），女，四川成都市人，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锛夹g(shù)與食品安全。