大腸桿菌O抗原定型血清標(biāo)定用抗原的制備

張媛，王秀麗，劉博，張磊，李建，彭國瑞，辛凌翔，蔣玉文

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

大腸桿菌O抗原定型血清標(biāo)定用抗原的制備

張媛，王秀麗，劉博，張磊，李建，彭國瑞，辛凌翔，蔣玉文*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為研制用于標(biāo)定大腸桿菌菌體抗原(O抗原)單因子定型血清效價的抗原，以大腸桿菌參考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)為菌種，經(jīng)條件優(yōu)化確定了抗原制備的工藝。檢測結(jié)果表明，當(dāng)菌液調(diào)整至OD600 nm值為0.147±0.026時，各型抗原的濃度為1×109CFU/mL,將其熱處理后制備成反應(yīng)抗原。按此吸光值各自制備3批抗原，3批抗原與血清的凝集價均分別一致，分別達(dá)到211(O2)、212(O7)及29(O74)。用180種大腸桿菌O抗原單因子定型血清對制備的抗原進(jìn)行檢測，制備的抗原僅與其對應(yīng)型的血清發(fā)生特異性反應(yīng)，與其余179種血清均不發(fā)生反應(yīng)。研究結(jié)果顯示，制備的抗原具有較好的穩(wěn)定性及特異性，可以用于大腸桿菌菌體單因子定型血清效價的標(biāo)定。

大腸桿菌；菌體抗原；單因子血清

大腸桿菌菌體抗原(O抗原)是大腸桿菌的脂多糖分子的一部分，是菌株血清分型的主要依據(jù)。大腸桿菌的O抗原型非常多，至今已發(fā)現(xiàn)180種之多。研究資料表明，常引起豬大腸桿菌病的血清型有O1、O2、O3、O6、O8、O9、O11、O14、O15、O17、O18、O20、O22、O23、O24、O26、O32、O35、O38、O44、O45、O48、O51、O52、O53、O54、O55、O60、O64、O65、O78、O89，O91、O93、O97、O98、O101、O102、O104、O107、O115、O118、O119，O125、O126、O132、O137、O138、O139、O141、O147、O149、O152、O153、O156、O157、O159、O163等[1～5]。雞大腸桿菌病通常是由O1、O2、O78三種血清型的大腸桿菌所引起，此外也有研究學(xué)者從發(fā)病雞病料中分離到血清型為O3、O4、O8、O9、O11、O15、O18、O20、O22、O26、O30、O35、O36、O38、O50、O60、O75、O76、O81、O88、O89、O93、O103、O111、O114、O115、O127、O128、O131、O133、O143、O149、O152、O159、O161的大腸桿菌[6～8]。鴨致病性大腸桿菌的血清型以O(shè)76、O78、O92、O142最為常見[9]。奶牛致病性大腸桿菌血清型中以O(shè)6、O10、O17、O21、O51、O53、O60、O77、O92、O101、O125、O148、O158較為普遍[10～11]。犬、貓、鴿子等寵物致病性大腸桿菌的優(yōu)勢血清型是O10、O24、O64、O119、O137、O147、O149、O157等[12]。

血清學(xué)方法是鑒定大腸桿菌O抗原型的經(jīng)典方法。一株大腸桿菌只具有單一O抗原型，但是，現(xiàn)今國內(nèi)相關(guān)血清產(chǎn)品由于生產(chǎn)工藝粗糙，往往鑒定不出菌株的單一血清型。本課題組擬改進(jìn)大腸桿菌O抗原定型血清生產(chǎn)工藝，制備出特異性良好的單因子定型血清，在制備過程中需要使用反應(yīng)抗原對血清進(jìn)行類屬凝集素的篩查，并對血清進(jìn)行效價標(biāo)定，這就需要反應(yīng)抗原自身的質(zhì)量穩(wěn)定，達(dá)到不同批次抗原與同一血清的凝集程度一致。本研究利用大腸桿菌參考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)進(jìn)行可用于標(biāo)定大腸桿菌菌體單因子定型血清效價的抗原的制備。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 菌株 大腸桿菌CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)，由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通肉湯、普通瓊脂，購自北京中海動物保健科技公司。

1.1.3 試劑 大腸桿菌O抗原定型血清，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細(xì)菌制品檢測室提供。大腸桿菌O抗原單因子定型血清，購自丹麥國家血清研究院(SSI)。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司。THZ-C型恒溫振蕩器購自太倉市實驗設(shè)備廠。Herasafe KS生物安全柜購自德國Heraeus公司。酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法 本試驗開展了用于制備大腸桿菌菌體抗原的細(xì)菌最適增值條件、抗原濃度的確定、菌液吸光值的測定、熱處理方式的優(yōu)化、保存期試驗等研究，明確了抗原制備工藝，并檢查了抗原特異性，具體試驗方法如下：

1.2.1 制備抗原用菌液最適增殖條件的確定 將大腸桿菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株凍干菌種接種普通肉湯培養(yǎng)基復(fù)壯后，劃線接種普通瓊脂培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)16、20、24 h后，分別挑取單菌落接種100 mL普通肉湯培養(yǎng)基，37 ℃靜置及37 ℃ 200 r/min振蕩分別培養(yǎng)6 h及24 h。通過活菌計數(shù)[13]測定各組菌液濃度。

1.2.2 抗原濃度的確定 按上述確定的細(xì)菌生長條件制備大腸桿菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株菌液，將菌液分別調(diào)整為6×109CFU/mL、4×109CFU/mL、2×109CFU/mL、1×109CFU/mL、5×108CFU/mL、3×108CFU/mL、1×108CFU/mL、6×107CFU/mL 8個濃度后，經(jīng)121 ℃高壓2 h后制備成反應(yīng)抗原。將由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細(xì)菌制品檢測室提供的與3種抗原相對應(yīng)的O2、O7、O74大腸桿菌O抗原定型血清分別進(jìn)行對倍系列稀釋至212。將不同濃度抗原與相應(yīng)的不同稀釋度血清進(jìn)行棋盤反應(yīng)，以與最高稀釋倍數(shù)血清發(fā)生凝集的抗原濃度為最適抗原濃度。

1.2.3 菌液吸光值的測定 按上述確定的細(xì)菌生長條件制備大腸桿菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株菌液，將菌液分別進(jìn)行2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀釋后，分別測定不同稀釋度菌液OD600nm值，并計算菌液濃度。以菌液濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600nm值為縱坐標(biāo)，分別計算線性回歸方程，并通過方程確定最適抗原濃度所對應(yīng)的吸光值范圍。

1.2.4 菌液熱處理方式的優(yōu)化 按上述確定的細(xì)菌生長條件制備大腸桿菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株菌液，用生理鹽水將其調(diào)整到OD600nm值在最適抗原濃度所對應(yīng)的吸光值范圍內(nèi)，分別采用沸水浴及121 ℃高壓30、60、90、120 min的方式進(jìn)行熱處理。通過微量凝集試驗用大腸桿菌O抗原定型血清測定各組抗原效價。

1.2.5 抗原生產(chǎn)工藝的制定 將上述最適細(xì)菌增殖條件、菌液濃度調(diào)整及熱處理方式進(jìn)行匯總，制定出大腸桿菌O抗原制備工藝。

1.2.6 抗原質(zhì)量評價 每株菌均制備3批菌液，將菌液濃度調(diào)整到OD600nm值在最適抗原濃度所對應(yīng)的吸光值范圍內(nèi)，計算菌液濃度，然后經(jīng)最優(yōu)方式熱處理后制備成反應(yīng)抗原。對制備好的血清型分別為O2、O7、O74的大腸桿菌抗原，用丹麥國家血清研究院(SSI)生產(chǎn)的單因子定型血清進(jìn)行特異性檢查，并測定各批抗原的凝集價。

1.2.7 抗原保存期試驗 抗原等量分裝后置2～8 ℃保存，每個月取出1瓶進(jìn)行性狀、無菌檢驗、效價測定及均一性檢查。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌增殖條件優(yōu)化 CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414三株菌均為劃線接種平板37 ℃培養(yǎng)20 h后,取單菌落接種普通肉湯培養(yǎng)基37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后菌液濃度最高(表1)。

表1 大腸桿菌不同培養(yǎng)條件菌液濃度測定(單位：CFU/mL)

注：加下劃線為各菌株菌液濃度的最高值

2.2 抗原濃度的確定 CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414三株菌制備的反應(yīng)抗原濃度均為1×109CFU/mL時與對應(yīng)血清發(fā)生凝集的凝集價最高(表2、表3、表4)。

表2 CVCC1345大腸桿菌抗原與不同稀釋度O2血清凝集價測定

注：“+”表示凝集，“-”表示不凝集，加下劃線為與血清凝集價最高的抗原濃度

表3 CVCC1350大腸桿菌抗原與不同稀釋度O7血清凝集價測定

注：“+”表示凝集，“-”表示不凝集，加下劃線為與血清凝集價最高的抗原濃度

表4 CVCC1414大腸桿菌抗原與不同稀釋度O74血清凝集價測定

注：“+”表示凝集，“-”表示不凝集，加下劃線為與血清凝集價最高的抗原濃度

2.3 菌液吸光值測定結(jié)果 將3種菌液均進(jìn)行2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀釋，測定菌液濃度與吸光值的線性回歸方程(表5)。通過線性回歸方程計算出抗原型分別為O2、O7、O74的大腸桿菌菌液，濃度為1×109CFU/mL時所對應(yīng)的OD600nm值分別為0.125、0.184、0.132，平均值為0.147，標(biāo)準(zhǔn)差為0.026，由此可知，培養(yǎng)后的菌液調(diào)整至OD600nm值在0.147±0.026范圍內(nèi)，菌液濃度約為1×109CFU/mL。

表5 大腸桿菌菌液濃度與吸光值的線性回歸方程

注："x"表示菌液濃度的對數(shù)值，"y"表示菌液OD600nm值

2.4 菌液熱處理方式的確定 大腸桿菌菌液通過熱處理破壞莢膜抗原(K抗原)，使O抗原暴露與O血清發(fā)生凝集。不同菌株培養(yǎng)菌液采用121 ℃高壓60 min的熱處理方式，抗原凝集價均可達(dá)到最大值(表6)。

表6 大腸桿菌菌液不同熱處理方式及時間制備的抗原效價測定

注：加下劃線為各抗原凝集價的最高值

2.5 抗原制備工藝 菌株復(fù)壯后，劃線接種普通瓊脂平皿，37 ℃培養(yǎng)20 h后，取單菌落接種普通肉湯100 mL，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h后，用普通肉湯將其稀釋至OD600nm值為0.147±0.026，121 ℃高壓1 h，待其恢復(fù)室溫后，按0.1%加入甲醛溶液，定量分裝，置2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 抗原質(zhì)量評價結(jié)果 不同菌株3次制備的菌液稀釋至OD600nm值為0.147±0.026時，菌液濃度均為1×109CFU/mL，各抗原僅與其相對應(yīng)的血清發(fā)生凝集反應(yīng)，與其他型血清均不反應(yīng)，說明抗原特異性良好，抗原凝集價分別相同(表7)。

表7 不同批次抗原吸光值及凝集價

2.7 抗原保存期試驗結(jié)果 抗原置2～8 ℃至少可保存13個月(表8)。

表8 不同保存時間抗原的質(zhì)量評價

3 討論與小結(jié)

大腸桿菌病是一類重要的人畜共患病，多項關(guān)于致病性大腸桿菌檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中都要求對其O抗原進(jìn)行血清學(xué)凝集試驗，以確定其O抗原型[14-15]。目前已知的大腸桿菌O抗原型有180種，制備大腸桿菌O抗原定型單因子血清的基礎(chǔ)就是要先制備出該180種反應(yīng)抗原，且要求對抗原濃度予以確定，從而保證不同批次抗原與同一批次血清的凝集結(jié)果相一致，進(jìn)而保障不同批次血清效價的一致性。本課題組通過試驗明確了最適抗原濃度為1×109CFU/mL，要把抗原固定在此濃度雖可采用活菌計數(shù)的方法直接確定菌液濃度，但由于要制備180種抗原，若逐一進(jìn)行活菌計數(shù)，工作量巨大，不適用生產(chǎn)化，故未采用。本研究采用了測定菌液濁度的方法確定菌液濃度，由于與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁的方法人為判斷誤差較大，故沒有采用，而是選用了測定菌液吸光值的方法。通過探尋吸光值與菌液濃度間的平行關(guān)系，最終確定將培養(yǎng)后的菌液稀釋至OD600nm值為0.147±0.026時，菌液濃度約為1×109CFU/mL。為了驗證此吸光值范圍確定的是否準(zhǔn)確，制備了O2、O7、O74三種抗原各3批，分別將濃度調(diào)整到OD600nm值為0.147±0.026時與各自對應(yīng)血清進(jìn)行凝集反應(yīng)，結(jié)果顯示各血清型3批抗原的凝集價分別一致，說明通過測定菌液OD600nm值可以固定抗原濃度。

在以往大腸桿菌O抗原制備過程中采用121 ℃高壓2 h的方式進(jìn)行熱處理，丹麥國家血清研究院(SSI)推薦的大部分抗原的熱處理方式是沸水浴1 h，但對個別抗原仍推薦高壓的方式。本課題組比較了沸水浴及121 ℃高壓分別熱處理30、60、90、120 min對抗原凝集價的影響，結(jié)果表明不同菌株培養(yǎng)菌液采用121 ℃高壓1 h的熱處理方式抗原凝集價均可達(dá)到最大值。

本課題組明確了抗原制備工藝，為繼而制備180種反應(yīng)抗原奠定了基礎(chǔ),且制備的抗原各項指標(biāo)經(jīng)檢測均合格，無菌、特異、均一、穩(wěn)定，可以用于大腸桿菌菌體單因子定型血清效價的標(biāo)定?？乖?～8 ℃條件下至少可保存13個月。

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(編輯：侯向輝)

The Preparation ofE.coli’s Antigen which Calibrate the Titer of the Mono-Factor Stereotype Serum

ZHANG Yuan, WANG Xiu-li, LIU Bo, ZHANG Lei, LI Jian，PENG Guo-rui, XIN Ling-xiang, JIANG Yu-wen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugsControl，Beijing100081，China)

In order to develop antigen that can be used to calibrate the titer ofE.colibacteria’s single factor stereotype serum. In this study theE.coli

train CVCC1345 (O2), CVCC1350 (O7), CVCC1414 (O74) as a species, is determined by the conditions to optimize their production processes. Our test results showed that the bacteria which will be prepared as the antigen after the heat treatment adjusted to OD600nmvalue of 0.147±0.026, the concentration of 1× 109CFU/mL. According to this absorbance value of each antigen, we have 3 batches of the prepared antigen. Three batches of antigen and serum agglutination titer are consistent respectively which reached 211(O2), 212(O7) and 29(O74). We tested the prepared antigen with 180 kinds of mono-factor stereotype serum ofE.coli, only the prepared antigen of the corresponding type of serum could react specifically, the rest of the 179 kinds of serum not react. The results showed that the prepared antigen having better stability and specificity ofE.colibacteria can be used to calibrate the titer of the mono-factor stereotype serum.

Escherichiacoli; bacterial antigen; mono -factor stereotype serum

張媛,副研究員，從事需氧菌類生物制品檢測研究。

2016-08-09

A

1002-1280 (2016) 12-0012-07

S852.61