賽庚啶ELISA檢測試劑盒的研制及其性能評價

黃士新，李丹妮，顧欣，黃華, 陳亮，王學生

(1.上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103；2.上海容暉生物科技有限公司，上海 200231)

賽庚啶ELISA檢測試劑盒的研制及其性能評價

黃士新1，李丹妮1，顧欣1，黃華2, 陳亮2，王學生2

(1.上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103；2.上海容暉生物科技有限公司，上海 200231)

基于直接競爭法原理酶聯(lián)免疫技術研制了一種測定動物尿液中賽庚啶(CHP)殘留量的檢測試劑盒，并對試劑盒的檢測限、特異性和穩(wěn)定性等參數(shù)進行確定。通過在CHP分子上引入活性羧基，在EDC作用下分別偶聯(lián)到KLH、BSA上形成CHP-KLH和CHP-BSA抗原，CHP-KLH抗原免疫BALB/C小鼠制得抗CHP單克隆抗體，經辣根過氧化物酶HRP標記抗CHP抗體，采用CHP-BSA抗原包被酶標板，最終成功構建動物尿樣中CHP殘留量的競爭酶聯(lián)免疫法檢測體系，并進行性能測試評價。結果表明，吸光度百分比值與CHP質量濃度的對數(shù)在0.1～1.6 μg/L呈線性關系，相關系數(shù)R2為0.986，半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.316 μg/L，檢測限為0.158 μg/L，回收率在80%～110%，變異系數(shù)為2.0%～10.0%。方法具備良好的特異性，可用于動物尿樣、血清及組織中CHP殘留的快速檢測。

動物尿樣；賽庚啶；競爭酶聯(lián)免疫；單克隆抗體；試劑盒

賽庚啶(Cyproheptadine，CHP)是一種抗組胺藥物，也是一種H1受體拮抗藥，同時具有抗5-羥色胺的作用，可抑制下丘腦的飽覺中樞而刺激食欲增加體重促進生長。在動物飼料和動物飲水中非法添加這種藥物，會造成動物體內藥物殘留，嚴重危害人體的健康[1-3]。農業(yè)部于2010年12月27日發(fā)布1519號公告，禁止在飼料和動物飲水中使用鹽酸CHP[4]。

目前動物尿液中CHP檢測方法主要為液相色譜-串聯(lián)質譜色法(LC/MS/MS)和高效液相色譜法(HPLC)，但均存在檢測時間長和檢測成本高等缺點，不適用于快速篩查。本研究通過化學偶聯(lián)的方法將CHP連接到載體蛋白上，成功制備了特異性識別CHP的單克隆抗體，并根據(jù)免疫競爭的原理，建立了一種適用于動物尿樣、血樣中CHP殘留檢測的酶聯(lián)免疫檢測體系，還成功研制出商品化快速檢測試劑盒，以期為現(xiàn)場篩查提供具有操作簡單、靈敏高、特異性好、檢測時間短等優(yōu)勢的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 CHP標準品(純度≥99%)、碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)(純度≥99%、牛血清白蛋白(BSA)、血藍蛋白(KLH)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇(PEG，Mw4000)、HAT及HT選擇性培養(yǎng)基、8-氮雜鳥嘌呤(8-AG)、二甲亞砜(DMSO)、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等均購自美國Sigma公司；DMEM基礎培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司；辣根過氧化物酶(HRP)購自上海雪滿生物公司；N,N-二甲基甲酰胺(GR)等其他化學試劑購自國藥集團，BABL/C小鼠來自上海交大醫(yī)學院。

1.1.2 儀器與設備 酶標儀360T，上海科華公司；旋轉蒸發(fā)儀R-215，Buchi Labortechnik AC；高速冷凍離心機CT14RDII，上海天美；紫外分光光度儀UV-7502PC，上海欣茂儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CHP抗原的制備[5-7]通過對CHP硝化還原在CHP側苯環(huán)引入氨基得CHP-NH2，CHP-NH2再和溴丁酸合成半抗原CHP-COOH，其合成路線見圖1。

圖1 半抗原CHP接臂合成路線

反應瓶中加入原料鹽酸CHP 0.5 g和5 mL濃硫酸，攪拌溶解，分次加入濃硝酸和濃硫酸混合物，反應得硝基化合物。將硝基化合物0.5 g溶于水中，攪拌下依次加入濃鹽酸0.55 mL、鋅粉0.62 g，反應2 h，抽濾得得半固體狀黃色物質，層析后得CHP氨基化合物CHP-NH2。加乙酸乙酯和吡啶反應處理后得半抗原CHP-COOH。將2 mg半抗原溶于pH 為6.0的2-嗎啉乙酸(MES)水溶液中，4 ℃攪拌過夜。對0.01 mol/L pH7.2 PBS透析48 h可收集賽庚啶的完全抗原CHP-KLH?？乖瑿HP-BSA或CHP-OVA制備方法相同。

1.2.2 CHP抗體制備[8-9]將CHP-KLH的免疫抗原按50 μg/mL只的劑量與等體積弗氏佐劑充分乳化后，腹部皮下多點注射免疫4只6～8周齡雄性BALB/C小鼠，免疫7～10 d，尾靜脈采血，間接ELISA檢測血清效價。將免疫效果較好的小鼠脾臟與骨髓瘤細胞SP2/0通過PEG介導融合，間接ELISA篩選陽性克??；陽性克隆經有限稀釋亞克隆后獲得遺傳穩(wěn)定的單克隆細胞株，細胞株擴大培養(yǎng)后，接種經降植烷致敏BALB/C小鼠腹腔誘導生產單克隆抗體的腹水[8]。腹水經硫胺粗純化，再辛酸硫胺法純化得相應單抗[8]。

用辣根過氧化物酶(HRP)標記CHP單克隆抗體，采用過碘酸鈉法(改良法)標記。取1 mg CHP單克隆抗體在50 mM pH9.6碳緩沖液CBS中透析過夜，加入0.5 mg經過碘酸鈉醛化的HRP溶液，4℃反應2 h；加入硼氫化鈉溶液終止反應，將溶液裝入透析袋中，在PBS中透析過夜；透析完畢后取出，加入等體積甘油，-20℃避光保存[9]。

1.2.3 CHP完全抗原的包被 用50 mmol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液將CHP抗原(CHP-BSA)稀釋成系列濃度，依次包被到96孔酶標板，每孔包被量100 μL，濃度從0.5～8 μg/μL。4 ℃孵育過夜，將孔中液體傾去，每孔加入250 μL 0.5% BSA 10 mmol/L PBS pH 7.4封閉，于37 ℃恒溫箱中孵育2 h，將孔中封閉液傾去，放入溫度37 ℃、相對濕度20%的烘房烘干，鋁箔包裝放存4℃待用[8]。

1.2.4 樣品檢測 在每孔中加入50 μL系列濃度的CHP標準品溶液(或樣品溶液)和100 μL稀釋后的酶標CHP抗體，25 ℃反應30 min；洗滌4～5次后加入100 μL底物顯色液，25 ℃顯色反應20 min；最后加入50 μL終止液終止反應，設定酶標儀于波長450 nm處測定吸光度值[7]。

1.2.5 線性范圍 用陰性豬尿配制不同濃度CHP系列標準溶液，按要求對樣品處理后，在最優(yōu)抗原-酶標抗體工作濃度下，測定OD450值。

1.2.7 抗體的特異性 CHP和類似藥性的特非那定、鹽酸苯氧丙酚胺、芬司匹利和克倫特羅等4種藥物配成相應的濃度進行交叉反應，得出各種藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)，然后計算交叉率，交叉率=IC50(CHP)/IC50(其他藥物)×100。

1.2.8 試劑盒的準確度和精密度 在空白豬尿樣中分別添加不同濃度的CHP標準品，添加濃度為0.15、0.2、0.5 ng/mL，每個濃度重復3次，對3批試劑盒進行測定。

1.2.9 試劑盒穩(wěn)定性試驗 將試劑盒在37 ℃環(huán)境中存放7 d，取出后按照試劑盒操作程序測定其標準曲線的OD450值，并與4 ℃存放條件下的同批次試劑盒標準曲線OD450測定值進行比較。

2 結果

2.1 線性范圍 表1的實驗結果表明，在0.1～1.6 ng/mL濃度范圍內，CHP抗原、抗體的抑制反應最佳，如圖2所示吸光值在濃度0.1～1.6 ng/mL之間曲線形狀呈指數(shù)形。B/B0的百分比值與CHP質量濃度的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關系(圖3)，線性回歸方程為Y=-52.26X+23.80，相關系數(shù)R2為0.986，半數(shù)抑制濃度IC50為0.316 ng/mL。

表1 不同CHP濃度時OD450值

2.3 抗體的特異性 CHP試劑盒與相似藥物的交叉反應率實驗結果見表2，表明CHP試劑盒與類似

圖2 在450nm下不同賽庚啶濃度吸光值

圖3 CHP濃度取半對數(shù)的回歸曲線

藥性的特非那定、鹽酸苯氧丙酚胺、芬司匹利和克倫特羅等4種藥物無交叉反應，特異性較高。

2.4 試劑盒的準確度和精密度 平均添加回收率及變異系數(shù)計算結果如表3所示，豬尿中CHP藥物的添加回收率在80%～110%之間；在批內、批間的變異系數(shù)1.8%～9.4%之間，表明該ELISA試劑盒具有良好的準確性和精密性，可以滿足動物尿液中CHP藥物殘留測定要求。

表2 CHP抗體對其他藥物的交叉反應率

表3 準確度和精密度測定結果

2.5 試劑盒的符合性 從試劑盒的假陰性、假陽性測定以及儀器檢測樣品比對情況評估其符合性。2.5.1 假陰性率 在已確認的陰性樣品中添加不同濃度的賽庚啶標準品，評價試劑盒的假陰性。陽性添加樣本的測定結果均為陽性，未發(fā)現(xiàn)假陰性(表4)。

表4 CHP的試劑盒假陰性評價結果 μg/L

2.5.2 假陽性率 取40份經儀器確認的陰性尿樣，試劑盒測定結果濃度低于0.1 ng/mL的有32份，濃度低于0.2 ng/mL的有8份，結果判定均為陰性，未出現(xiàn)假陽性。

2.5.3 與儀器測定進行比對 取50份空白豬尿樣品，隨機添加CHP標品，制得50份盲樣，分別采用ELISA試劑盒盒液相色譜-串聯(lián)質譜進行測定，儀器方法參照DB31/T 《豬尿中賽庚啶殘留量的測定 酶聯(lián)免疫吸附法與液相色譜-串聯(lián)質譜法》所述進行操作。經檢測40份樣品確認為陰性，10份檢測結果大于0.2 ng/mL，判定為陽性，ELISA檢測結果與液相色譜-串聯(lián)質譜檢測結果相符，表明此試劑盒的符合性高。

2.6 試劑盒的穩(wěn)定性 根據(jù)生化試劑在37 ℃穩(wěn)定7 d相當于4～10 ℃穩(wěn)一年左右的原則，在37 ℃條件下進行加速穩(wěn)定性試驗。試劑盒在37 ℃ 7 d中陰性值吸光值僅降了5%左右。試劑盒在37 ℃ 7 d標準曲線和存放4 ℃時曲線變化較小(圖4)， IC50值分別0.330和0.331，說明試劑盒在規(guī)定條件存放有效期一年左右。

圖4 賽庚啶試劑盒在37℃和4℃時吸光值和濃度變化

3 討論

3.1 CHP特異性抗體的制備 CHP是小分子物質，本身不具備免疫原性，要制備CHP的抗體必須現(xiàn)將CHP小分子連接到一個大分子載體蛋白上，通過免疫動物來獲得抗體。通過化學偶聯(lián)的方法將CHP連接到載體蛋白上，首次成功制備了特異性識別CHP的單克隆抗體。

3.2 包被抗原-酶標抗體工作濃度選擇 采用方陣試驗法對直接競爭ELISA法中包被抗原和酶標抗體的稀釋度進行篩選并確定工作濃度，一般原則選擇OD450值2.0左右時的濃度組合作為最適工作濃度。試驗分別比較了不同的酶標抗體稀釋濃度1∶1000、1∶5000、1∶10000、1∶20000，與不同包被抗原濃度0.5～8.0 μg/mL的濃度情況下的OD450，得到最優(yōu)濃度組合為：抗原包被濃度為1～2 μg/mL，酶標抗體稀釋比1∶10000，此時的OD450值為2.135～2.201。

本研究通過合成CHP完全抗原和免疫其動物制備相應的特異性單克隆抗體，建立了競爭ELISA試劑盒，經性能分析測試，說明此試劑盒特異性好、準確性和重復性高等特點，完全適用于檢測部門、中小企業(yè)以及生畜養(yǎng)殖業(yè)對動物尿樣、血清和組織中的賽庚啶殘留檢測，同時也為食品和飼料中賽庚啶殘留的監(jiān)控提高了便捷、靈敏、快速的檢測方法。

[1] 陳其煌. 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定豬尿液中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶[J]. 福建農業(yè)學報, 2012,(6):596-600.

[2] 黃炎坤,韓占兵,王娟娟, 等. 氯丙嗪和賽庚啶對黃羽肉種雞產蛋性能的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2008, (1):35-36.

[3] 萬宇平,羅曉琴,郝小妹, 等. 動物組織中賽庚啶競爭酶聯(lián)免疫法的建立[J]. 中國釀造, 2014, 10:130-132.

[4] 中華人民共和國農業(yè)部第1519號公告 [S]．

[5] Kuhn W E. Organic Syntheses Coll[M]. New York Organic Syntheses, Inc. Vol. 2, 1943: 447.

[6] Kuhn W E. Organic Syntheses Coll[M]. New York Organic Syntheses, Inc. Vol 13, 1933:74.

[7] Prugh John D. Piperidylidene derivatives of cyano-5H-dibenzo[a,d]cycloheptene[P]: United States, US 3988342,1976-10-26.

[8] 朱立平，陳學清. 免疫學常用實驗方法[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2000.

[9] 巴德年.當代免學技術與應用[M]. 北京：北京醫(yī)科大學、中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1998.

(編輯：李文平)

Development and Performance Measurement of Cyproheptadine ELISA Test Kit

HUANG Shi-xin1, LI Dan-ni1, GU Xin1, HUANG Hua2,CHEN Liang2, WANG Xue-sheng2

(1.ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai201103,China；2．RohiBiotechnologyCo.Ltd,Shanghai200231,China)

A direct competitive ELISA assay was developed in order to detect cyproheptadine in the samples of animal urine, and its technical parameters, such as sensitivity, specificity and stability were tested respectively. By introducing an active carboxyl group to cyproheptadine molecules, the hapten cyproheptadine was conjugated to keyhole limpet hemocyanin(KLH) and bovine serum albumin(BSA) by EDC method. Immnunized the Balb/c mice with CHP-KLH antigen，the monoclonal antibodies against cyproheptadine were acquired. The monoclonal antibodies were labeled with horseradish peroxidase. Coated CHP-BSA antigen on the plate wells, the direct competitive ELISA assay was developed for detecting cyproheptadine in the samples. The results showed that the logarithm of cyproheptadine concentration with the absorbance percentage shows a linear relationship between 0.1～1.6 μg/L, the correlation coefficientR2is 0.986, the half inhibitory concentration (IC50) is 0.316 μg/L, the detection limit for cyproheptadine the assay is 0.158 μg/L, the recovery is 80%～110%, the coefficient of variation is 2.0%～10.0%. This assay exhibits good specificity with no any cross reactions to terfenadine and clenbuterol. It could be used as rapid detection for the residual cyproheptadine in the samples such as animal urine, serum and tissues.

animal urine; cyproheptadine; competitive ELISA; monoclonal antibody; test kit

國家公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201203023)；上海市科技興農重點攻關項目 [滬農科攻字(2014)第3-3號]

2016-08-24

A

1002-1280 (2016) 11-0044-05

S859.8