五加芪粉對雞免疫新流二聯(lián)滅活疫苗免疫效果的影響

潘貴珍，周德剛，高艷艷，李召斌

(國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽 471003)

五加芪粉對雞免疫新流二聯(lián)滅活疫苗免疫效果的影響

潘貴珍，周德剛，高艷艷，李召斌

(國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽 471003)

研究了五加芪粉對雞免疫新流二聯(lián)滅活苗后免疫功能的影響。180只20日齡雞隨機(jī)分為6組，每組30只，分別為五加芪粉高、中、低劑量組、陽性藥物對照組、免疫對照組、空白對照組。于免疫后第10、17、24、31和38天檢測血清中新城疫抗體水平、禽流感抗體水平、IL-2含量，并于免疫后第38天檢測免疫器官指數(shù)。結(jié)果表明，0.2、0.5 g/L的五加芪粉組與免疫對照組相比，顯著或極顯著的提高了新城疫(ND)和禽流感(AI)抗體水平(P<0.05，P<0.01)。不同劑量的五加芪粉組和紫錐菊末組與免疫對照組相比，顯著或極顯著的提高了法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)(P<0.05，P<0.01)。免疫給藥后第31天， 0.2、0.5、1 g/L的五加芪粉組、紫錐菊末組與免疫對照組相比，顯著或極顯著的提高了IL-2的水平(P<0.05，P<0.01)，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明五加芪粉可以提高雞免疫新流二聯(lián)滅活疫苗免疫效果，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。

五加芪粉；新城疫；抗體

滅活疫苗免疫是目前預(yù)防低致病性H9N2亞型禽流感的重要防線。在我國H9N2亞型禽流感病毒的滅活疫苗已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，滅活全病毒疫苗安全性好，抗原組分齊全，免疫原性強(qiáng)，不會出現(xiàn)毒力返強(qiáng)和變異危險，能夠經(jīng)受同亞型禽流感病毒(AIV)的攻擊，能給免疫雞群提供一定的免疫保護(hù)。由于AIV血清型眾多，變異性強(qiáng)，給免疫預(yù)防工作帶來極大的挑戰(zhàn)。目前疫苗效力均已達(dá)到國際上要求的滅活苗標(biāo)準(zhǔn)，但新城疫病毒仍不能得到有效控制，有研究者[1]提出，目前常用新城疫疫苗毒株與當(dāng)前流行毒株基因型不匹配，免疫保護(hù)力不足。從分子遺傳學(xué)角度證實(shí)了VIId型NDV是導(dǎo)致新城疫免疫失敗的重要原因。新城疫和禽流感目前沒有特效藥物及疫苗， 只能通過增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，以預(yù)防為主。然而，因免疫程序不合理、一些免疫抑制病存在、集約化飼養(yǎng)環(huán)境、雞群受到驚嚇等，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激，導(dǎo)致機(jī)體免疫力和抗病力的下降，也會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。針對集約化養(yǎng)殖業(yè)中存在的問題，臨床生產(chǎn)中，確實(shí)需要一種能增強(qiáng)機(jī)體免疫力的產(chǎn)品。刺五加為五加科植物，其作為藥材用于臨床歷史悠久，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，現(xiàn)代研究表明其具有補(bǔ)中、益精、強(qiáng)意志、祛風(fēng)濕、壯筋骨、活血去瘀等功效[2]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗損傷、抗疲勞等作用[3]。黃芪的主要成分為黃芪多糖，具有促進(jìn)免疫器官發(fā)育[4]、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌[5-8]、增強(qiáng)T和B細(xì)胞功能[9]、增強(qiáng)機(jī)體免疫[10]、糾正創(chuàng)傷引起的細(xì)胞免疫功能紊亂等作用[11]。五加芪粉是由幾家公司研制開發(fā)的中藥免疫增強(qiáng)劑，由黃芪和刺五加經(jīng)提取、濃縮、噴霧干燥制成，本試驗(yàn)將五加芪粉與新流二聯(lián)滅活疫苗配合應(yīng)用，探討五加芪粉對雞免疫新流二聯(lián)滅活疫苗免疫效果的影響，以期為生產(chǎn)中提高雞群抵抗力，保證免疫效果奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動物 羅曼蛋公雛，1日齡，300只，購于洛陽畜康養(yǎng)殖場，常規(guī)飼養(yǎng)至20日齡備用。

1.2 藥品與試劑 五加芪粉，批號：20120201，由洛陽惠中獸藥有限公司提供；紫錐菊末(商品名：紫奇)，批號：1210002，購自齊魯動物保健品有限公司；新城疫(ND)標(biāo)準(zhǔn)抗原(批號：201205)、雞新城疫病毒血凝抑制試驗(yàn)(HI)陽性血清(批號：201301)，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原(批號：2015005)、禽流感病毒H9亞型陽性血清(批號：2014002)，均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。新城疫病毒(LaSota株)禽流感病毒(H9亞型：HL株)二聯(lián)滅活疫苗，批號：121258，由普萊柯生物工程股份有限公司提供；檸檬酸鈉，批號：F20090416，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；20×PBS，批號：130119081Z，購自上海生物工程股份有限公司；IL-2試劑盒購于美國的R&D：LOT-13-02(96T)；LOT-13-04(96T)。

1.3 試驗(yàn)器材 一次性96孔V型板(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；JA2003型電子天平(上海上平儀器有限公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；MM-2微量振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠)；微量移液器(德國Eppendorf)；Nu-425-400S生物安全柜(美國Nuaire公司)；SPF雞隔離器，設(shè)備型號：GJ-1，蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司；Sunrise酶標(biāo)儀(瑞士Teacan公司)。

2 方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組 選擇平均抗體效價在(0.8±0.2)log2、體重相近的180只20日齡健康雞，隨機(jī)分為6組，每組30只。除空白對照組外，其余各組雞只于22日齡時頸背部皮下注射雞新流二聯(lián)滅活疫苗，0.3 mL/羽。疫苗免疫后第2天，1～3組分別按照不同劑量給予五加芪粉；第4組給予紫錐菊末；第5、第6組不給藥。各組具體分組和給藥情況見表1。

表1 試驗(yàn)動物的分組及處理情況表

2.2 新城疫和禽流感抗體水平測定 分別于免疫前(0 d)和免疫后(10、17、24、31、38 d)，固定選取20只雞，采血，離心，分離血清。按常規(guī)方法用96孔“V”形血凝板進(jìn)行血凝抑制(HI)試驗(yàn)，抗體效價檢測方法參考2010年版《中國獸藥典》三部附錄12頁，血清抗體的血凝抑制效價以log2表示。

2.3 雛雞免疫器官指數(shù)的測定 在免疫后第38天，各組隨機(jī)抽取15只，稱體重。剖取法氏囊、脾臟、胸腺，用濾紙吸去表面的水分后，稱重，計(jì)算法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

法氏囊指數(shù)=法氏囊(mg)/體重(g)；脾臟指數(shù)=脾臟重(mg)/體重(g)；胸腺指數(shù)=胸腺(mg)/體重(g)。

2.4 血清細(xì)胞因子IL-2的檢測 血清白細(xì)胞介素-2(IL-2)，采用IL-2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒，依照說明書測定IL-2水平(10只/組)。

2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 18.0進(jìn)行處理，同日齡不同劑量組間比較采用方差分析法，顯著性用P值表示，其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 五加芪粉對雞新城疫抗體水平的影響 五加芪粉對雞新城疫抗體水平的影響見圖1。免疫后第10、31和38天時，0.2 g/L的五加芪粉組與免疫對照組相比極顯著提高了其ND抗體水平(P<0.01)。免疫后31 d和38 d，0.5 g/L的五加芪粉組與免疫對照組相比顯著或極顯著提高了其ND抗體水平(P<0.05，P<0.01)。免疫后38 d，1 g/kg飼料劑量的紫錐菊末組與免疫對照組相比顯著的提高了ND抗體水平(P<0.05)。

圖1 五加芪粉對雞ND抗體水平的影響(單位：log2)

3.2 五加芪粉對雞禽流感抗體(H9)水平的影響 五加芪粉對雞禽流感抗體(H9)水平的影響見圖2。由圖2可知， 免疫后10 d，0.5、0.2 g/L的五加芪粉與免疫對照組相比顯著或極顯著的提高了禽流感抗體水平(P<0.05，P<0.01)。免疫后17 d，不同劑量的五加芪粉、紫錐菊末組與免疫對照組相比，顯著的提高了禽流感抗體水平(P<0.05)。免疫后24、31、38 d，不同劑量的五加芪粉組與免疫對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖2 五加芪粉對雞禽流感抗體(H9)水平的影響(單位：log2)

3.3 五加芪粉對雞免疫器官指數(shù)的影響 五加芪粉對雞免疫器官指數(shù)的影響見圖3。免疫后第38天，0.5、1 g/L的五加芪粉組與免疫對照組相比極顯著的提高了法氏囊指數(shù)(P<0.01)，1 g/kg的紫錐菊末組與免疫對照組相比顯著的提高了法氏囊指數(shù)(P<0.05)。五加芪粉不同劑量組、紫錐菊末組與免疫對照組相比極顯著的提高了脾臟指數(shù)(P<0.01)。0.2、0.5、1 g/L的五加芪粉與免疫對照組相比極顯著的提高了胸腺指數(shù)(P<0.05，P<0.01)。

圖3 五加芪粉對雞免疫器官指數(shù)的影響(免疫后38 d)

3.4 五加芪粉對血清細(xì)胞因子IL-2水平的影響 五加芪粉對血清細(xì)胞因子IL-2水平的影響見圖4。免疫后17 d，免疫對照組和空白對照組相比極顯著的降低了IL-2水平(P<0.05)，其他組別與免疫對照組相比差異不顯著(P>0.05)。免疫后31 d， 0.2、0.5 g/L五加芪粉組、紫錐菊末組與免疫對照組相比，顯著的提高了IL-2的水平(P<0.05)。1 g/L五加芪粉組與免疫對照組相比，極顯著的提高了IL-2的水平(P<0.01)。免疫后38 d，1 g/L的五加芪粉組、紫錐菊末組與免疫對照組相比顯著的提高了IL-2的水平(P<0.05)，0.2、0.5 g/L的五加芪粉組與空白對照組相比，顯著的低于該組IL-2水平(P<0.05)。

圖4 五加芪粉對雞血清IL-2水平的影響(pg/mL)

4 討論和小結(jié)

抗體水平的高低直接反映機(jī)體的體液免疫狀態(tài)，抗體測定方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，因此選擇檢測抗體水平。雞只在14日齡時，進(jìn)行檢測，ND母源抗體效價為24左右，這與文獻(xiàn)[12]報道相一致，為避免母源抗體影響， 選擇20日齡的雞只進(jìn)行試驗(yàn)。雞免疫后6～10 d在血液中產(chǎn)生抗體，因此本實(shí)驗(yàn)選擇免疫后10 d檢測血清中抗體水平。試驗(yàn)結(jié)果表明，五加芪粉可以提前使ND抗體水平升高并且一直維持較高水平,五加芪粉可提前升高禽流感抗體水平。這對于提高雞群的抗病力具有重要意義。期望五加芪粉可以用于新流二聯(lián)滅活疫苗免疫前后，對疫苗免疫造成的應(yīng)激具有一定的緩解作用，可防止因機(jī)體抵抗力較低時進(jìn)行疫苗免疫，造成免疫失敗。是否對其他疫苗免疫后機(jī)體抗體水平有提高作用，還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)研究表明，不同劑量五加芪粉和紫錐菊末可提高羅曼蛋雞免疫器官指數(shù)。由此可知，五加芪粉可以促進(jìn)免疫器官的綜合發(fā)育，使雞群整體免疫器官機(jī)能增強(qiáng)。有研究顯示黃芪、刺五加聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，其免疫效果優(yōu)于單劑，且具有扶正健脾之功效，刺五加中藥復(fù)合制劑可以提高雛雞的生長速度和抗病能力，紅細(xì)胞花環(huán)率顯著提高，對免疫器官的發(fā)育有促進(jìn)作用[13]，與本研究結(jié)果相似。免疫后31、38 d，五加芪粉可以提高機(jī)體IL-2水平，說明其能激活T細(xì)胞和促進(jìn)B細(xì)胞分化和分泌抗體，和ND抗體水平產(chǎn)生時間相一致。IL-2能誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，增強(qiáng)單核細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞(NK)的殺傷活性，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

本試驗(yàn)對IL-2水平、免疫器官指數(shù)、抗體水平進(jìn)行測定，試驗(yàn)結(jié)果提示五加芪粉可以提高雞免疫新流二聯(lián)滅活疫苗后的免疫效果，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

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(編輯：侯向輝)

Effect of Wujiaqi Powder to Improve the Immune Efficacy of Inactivated Vaccine by Newcastle Disease Virus and Avian Influenza in Chicken

PAN Gui-zhen, ZHOU De-gang, GAO Yan-yan, LI Zhao-bin

(NationalResearchCenterforVeterinaryMedicine,Luoyang，Henan471003，China)

To explore the effect of Wujiaqi powder on immune efficacy of inactivated vaccine by newcastle disease virus(NDV)and avian influenza in chicken. 180 20-day-old chickens were averagely divided into 6 groups with 30 in each group，respectively，with the Wujiaqi at high, medium and low concentrations, in positive control, vaccination control and blank control group. At 10,17,24,31 and 38 days after inoculation, each group was detected serum antibody titers and IL-2 concentrations. The immune organ index was determined at 38 days after vaccination. The results indicated the groups of Wujiaqi powder(0.2 g/L, 0.5 g/L) could significantly improve the immune efficacy of vaccine(P<0.05,P<0.01), it also showed the bursa of fabricius index, spleen index and thymus index of the first four groups were significantly higher than that of corresponding vaccine control group(P<0.05,P<0.01) at 38 days after vaccination. At 31 days after vaccination, the groups of Wujiaqi powder and Zizhuiju powder could significantly or extremely significantly improve the level of IL-2 than vaccine control group(P<0.05,P<0.01). The conclusion was Wujiaqi powder could improve the immune efficacy. It would be as the candidate of effectively improving immunity.

Wujiaqi powder; NDV; antibody titer

潘貴珍,碩士，獸醫(yī)師，從事獸醫(yī)藥效評價及臨床研究。E-mail：zhengui1986109@163.com

2016-01-14

A

1002-1280 (2016) 03-0011-05

S853.72