水楊苷對照品的制備工藝

房春林，吳學(xué)淵，楊海涵，李超，唐華僑

(1．成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 611130；2．成都乾坤動物藥業(yè)有限公司，成都 611130)

水楊苷對照品的制備工藝

房春林1，吳學(xué)淵2，楊海涵2，李超2，唐華僑2

(1．成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 611130；2．成都乾坤動物藥業(yè)有限公司，成都 611130)

從白柳皮中提取分離水楊苷，并通過純化工藝，制備水楊苷對照品。采用大孔樹脂分離、正丁醇萃取、重結(jié)晶方法從白柳皮中提取水楊苷，經(jīng)熔點和比旋度測定、元素分析、紅外光譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振譜進行水楊苷的鑒別，并采用HPLC-UV進行水楊苷純度測定。結(jié)果表明其含量為99.19%，純度大于99%，符合中藥標準品(供含量測定用)的要求。

白柳皮；水楊苷；提取；對照品

楊樹花為楊柳科植物毛白楊 (PopulustomentosaCarr．)、加拿大楊(PopuluscanadensisMoench)或同屬數(shù)種植物的干燥雄花序，收載于《中國獸藥典》2010年版二部，具有清熱解毒、化濕止瀉的功效，主治濕熱下痢、幼畜泄瀉[1]。楊樹花藥材的質(zhì)量控制僅進行簡單的理化性質(zhì)鑒別，未有相關(guān)活性成分的薄層及含量測定。研究表明，楊樹花主要活性成分之一為水楊苷，具有顯著抗炎作用，對仔豬腹瀉引起的炎癥反應(yīng)具有抑制作用[2]。水楊苷在楊樹花中的含量為0.16%～0.2%，為了提高楊樹花藥材質(zhì)量標準，同時為了研制含楊樹花藥材的新獸藥復(fù)方制劑，其質(zhì)量控制需要對水楊苷進行含量測定，而目前我國尚未有法定的水楊苷對照品。為此，有必要對水楊苷對照品的提取工藝進行系統(tǒng)研究，從而為制備合格的水楊苷對照品提供依據(jù)。本研究從柳屬植物白柳的皮中提取水楊苷，制備了符合中藥對照品(供含量測定用)要求的水楊苷。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑 甲醇、乙酸乙酯、95%乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、丙酮、pH試紙(分析純，天津博迪化工股份有限公司提供)；氧化鈣、甲醇、三氯甲烷、正丁醇(分析純，成都科龍試劑有限公司提供)；乙腈、甲醇(色譜純，fisher公司)；純化水、注射用水(自制)。

1.1.2 材料 水楊苷對照品(歐洲藥典EP，含量99.6%，Y0000669)；硅膠 (100～200目、200～300目，青島海洋化工有限公司)；大孔樹脂D-101(中藍晨光化工研究院有限公司)；薄層硅膠板GF254(墨克公司)。白柳皮(Salix alba L)4 kg，采收季節(jié)：春夏；產(chǎn)地：山東。

1.2 白柳皮中水楊苷的提取方法

1.2.1 白柳皮中水楊苷提取工藝 取白柳皮4 kg，剪碎至2～5 cm長度的小段，加15倍量水煎煮提取兩次，每次1.5 h，合并兩液，濾過，濾液靜置過夜，取上層澄清提取液A(約95 L)，備用。

1.2.2 水楊苷純化工藝 大孔樹脂的預(yù)處理：參照說明書進行。吸附和解吸附：將以上提取液A加入大孔吸附樹脂中上樣吸附(速率：12 L/h)24 h以上，用水洗至流出液變?yōu)闇\黃色后，用20%乙醇洗樹脂至TLC檢測無水楊苷，收集20%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，得濃縮液B(約11 L)，保存?zhèn)溆谩?/p>

正丁醇萃?。喝饪s液B，加正丁醇萃取3次，每次7 L，合并萃取液，減壓回收正丁醇，回收完畢后,樣品中加少量甲醇，繼續(xù)回收溶劑，得水楊苷樣品粗品C(約142.6 g)。

正相硅膠法分離純化水楊苷：取硅膠(200～300目)1.5 kg，加3 L三氯甲烷-甲醇=8∶1溶液混合均勻，裝柱(7.5 cm×110 cm)；取樣品粗品C，加甲醇溶解，加硅膠200 g拌樣(100～200目，比例為樣品:硅膠=1∶2)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑后，上樣，依次采用三氯甲烷-甲醇比例依次為8∶1、5∶1、4∶1的溶液及純甲醇梯度洗脫，分段收集各流份(每種比例洗脫液約25 L，每段收集5 L)。洗脫產(chǎn)品分別以TLC檢測，合并含水楊苷且雜質(zhì)干擾小的洗脫液，回收適量溶劑，待析出晶體后，用少量甲醇潤洗，過濾，得水楊苷粗品D(9.5 g)，備用。

水楊苷的重結(jié)晶：取水楊苷粗品D，加適量甲醇(約500 mL)熱溶，室溫冷卻結(jié)晶，待析出晶體后，過濾，收集結(jié)晶，如此重復(fù)操作至濾液無色，收集結(jié)晶，至真空干燥箱中干燥，得水楊苷標準品(編號：SYG-5021)。

1.3 水楊苷的結(jié)構(gòu)鑒定 主要通過對制備得到的水楊苷進行熔點測定、比旋度測定、元素分析、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜鑒別(1H-NMR、13C-NMR)等研究，對其結(jié)構(gòu)進行確證。

1.4 水楊苷的純度檢測 通過HPLC-UV測定水楊苷的純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊苷對照品的提取 4 kg白柳皮經(jīng)提取、分離純化和重結(jié)晶，獲得水楊苷3.725 g。

2.2 水楊苷熔點 精密稱取制備得到的水楊苷1.0 g，放入自動熔點儀中進行熔點測定，設(shè)定起始溫度為198 ℃，終止溫度為202 ℃，升溫速率為0.5 ℃/min，結(jié)果表明，測定的樣品熔點為199.4～200.3 ℃,與文獻[3-4]記載的水楊苷的熔點基本一致，也與歐洲藥典對照品一致。

2.3 水楊苷比旋度 精密稱取制備得到的水楊苷0.60 g，加95%乙醇配制濃度為0.6g/100mL的溶液，加入自動旋光儀中于20 ℃溫度條件下進行比旋度測定，結(jié)果表明，測定的樣品的比旋度為-47.333，與文獻[3]記載水楊苷的比旋度(-45.6)基本一致。

2.4 水楊苷元素分析 精密稱取制備得到的水楊苷100 mg，照《JYT017-1996元素分析儀方法通則》進行C、H元素的測定，測定結(jié)果見表1。

表1 水楊苷元素分析結(jié)果

元素分析結(jié)果表明，C、H元素與水楊苷的分子式基本一致。

2.5 水楊苷紅外光譜鑒別 稱取制備得到的水楊苷(編號：SYG-5021)23.4 mg，加入KBr適量，研勻，壓片，進行紅外光譜測試。

圖譜解析：νmax：3473cm-1、3328cm-1(-OH)，1606 cm-1、1495 cm-1(C6H5-)，1035 cm-1(-O-)，761 cm-1(苯環(huán)鄰位取代)，從IR圖譜解析數(shù)據(jù)可判定該化合物為水楊苷。

2.6 水楊苷液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒別 稱取制備得到的水楊苷(編號：SYG-5021)21.3 mg，加甲醇25 mL，得濃度為0.848 mg/mL的溶液，取1 mL裝入質(zhì)譜管中，進行質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜圖譜見圖1。

液相色譜檢測條件為：色譜柱：Waters X Bridge C18:50 mm×4.6 mm×3.5 um；流動相A:乙腈(0.05%三氟乙酸)B：水(0.05%三氟乙酸)；梯度洗脫見表2；流速2.0 mL/min；柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件為：電離源：電噴霧離子源(ESI)；檢測方式：正、負離子檢測模式；掃描范圍：m/z100～1000；離子源溫度：350 ℃；霧化壓力：0.33 MPa；干燥氣流速：9.0 L/min；毛細管電壓：3.5 kV。

圖譜解析：m/z:304[M+H2O]+，水楊苷分子量為286，故可初步判定該化合物為水楊苷。

圖1 水楊苷質(zhì)譜圖譜

時間/min乙腈/%水/%0～1．65→10095→01．6～3．01000

2.7 水楊苷核磁共振譜鑒別 精密稱取制備得到的水楊苷(編號：SYG-5021)20.7 mg，放入核磁管中，于55 ℃條件下真空減壓干燥6 h后，加入D2O試劑1支，進行核磁共振鑒別，包括1H-NMR、13C-NMR鑒別，對試驗結(jié)果的圖譜解析如下。

13C-NMR解析：(400MHz，D2O，δ，)：129.7(C-1)，154.5(C-2)，115.3 (C-3)，129.4(C-4)，123.3(C-5)，129.6(C-6)，59.2(C-7)，100.5 (C-1’)， 72.9(C-2’)，76.1(C-3’)，69.4(C-4’)，75.6(C-5’)，60.5(C-6’)。

2.8 水楊苷純度的HPLC-UV測定 色譜條件的選擇：經(jīng)紫外光譜掃描，水楊苷在225、269 nm處均有明顯的紫外吸收，因此采用高效液相色譜連接紫外檢測器的方法對水楊苷樣品的純度進行檢測，通過前期對色譜條件篩選研究，確定液相色譜條件如下。色譜柱：(Agilent Zorbax SB C18 4.6×150 mm，5 μm)；檢測波長：225，269 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；流動相：采用梯度洗脫的方式，比例變化見表3。經(jīng)試驗驗證，在此色譜條件下，保留時間合理，35 min內(nèi)可完成全部雜質(zhì)分析。

供試品的制備：精密稱取制備得到的水楊苷(編號：SYG-5021)16.64 mg，至50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.5 mL至10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

表3 流動相梯度洗脫表

純度測定：將供試品溶液進樣10 μL，按上述色譜條件測定，記錄峰面積值和色譜圖，采用峰面積歸一化法計算樣品純度，結(jié)果表明，樣品在225 nm和269 nm兩種檢測波長條件下，測定其純度分別為99.27%和99.25%。色譜圖圖譜見圖2。

2.9 水楊苷含量測定 據(jù)文獻報道[8-9]，對照品的含量定值方法有兩種，即外標法和質(zhì)量平衡法，因水楊苷為常見的化合物，歐洲藥典(EP)收載有此化合物的標準物質(zhì)，因此，水楊苷屬于有可溯源標準物質(zhì)，因此本研究采用外標法進行自制對照品的含量定值研究。

圖2 水楊苷純度測定的HPLC-UV圖譜

色譜條件的選擇：結(jié)合對水楊苷含量測定方法建立的研究基礎(chǔ)，確定色譜條件如下：色譜柱(4.6×150 mm，5 μm)；檢測波長：269 nm；流動相：乙腈-水(6∶94)；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃ 對照品溶液的制備：精密稱取水楊苷對照品(EP)適量，加水制成每1 mL中含水楊苷0.0797 mg的溶液，即得。

水楊苷供試品溶液的制備：精密稱取制備得到

的水楊苷(自制，編號：SYG-5021)16.80 mg，共3份，至50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.5 mL至10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

自制水楊苷含量測定結(jié)果：分別將供試品溶液進樣10 μL，按上述色譜條件測定，記錄峰面積值和色譜圖，采用外標法(EP對照品)計算自制樣品的實際百分含量，結(jié)果見表4，圖譜見圖3。

表4 水楊苷(自制)含量測定結(jié)果

圖3 水楊苷(自制)含量測定HPLC圖譜

3 討論與小結(jié)

目前水楊苷在歐洲有法定的對照品銷售，可供相關(guān)定性及定量研究，在我國僅有Sigma公司銷售的作為一般研究的水楊苷化學(xué)類物質(zhì)，尚無法定的水楊苷對照品。因此本研究制備工藝可為制備水楊苷對照品提供一種新的方法。

3.1 提取原材料的選擇 水楊苷是獸用中藥材楊樹花的主要活性成分之一，具有顯著的解熱、鎮(zhèn)痛及抗炎作用，但楊樹花中水楊苷的含量較低，僅為0.16%～0.2%，選擇從楊樹花中提取水楊苷進行對照品的分離純化難度較大，但可以從其他含量較高的植物中進行水楊苷的提取分離。段紅等[10]研究表明，八角楓莖中水楊苷的含量約為0.229%，柳屬植物中如白柳、紫柳的樹皮中含量較高，趙永強[11]對3個產(chǎn)地的白柳皮進行了水楊苷的含量測定，其中山東產(chǎn)地含量高達2.28%，因此本研究選擇山東產(chǎn)白柳皮作為提取并制備水楊苷對照品的原材料。

3.2 提取純化工藝 關(guān)于水楊苷提取純化工藝研究報道較少，蒲凌云等[12]研究了大孔樹脂純化白柳皮中水楊苷的最佳提取工藝，提取的水楊苷含量僅為75.23%；段紅等[13]研究了采用大孔吸附樹脂純化八角楓中水楊苷工藝，其回收率大于78%，但未對水楊苷含量及純度進行分析；本研究在采用大孔樹脂D101初步分離水楊苷后，再經(jīng)過正丁醇萃取、正向硅膠柱層析及重結(jié)晶等工藝，所提取純化的水楊苷純度高于99.25%，含量達99.19%，完全符合中獸藥對照品要求。3.3 水楊苷含量測定方法及定值 水楊苷的含量測定方法在參考文獻報道基礎(chǔ)上建立[10,14]，并對檢測波長、流動相及流動相比例等進行了系統(tǒng)的實驗，

最終確定檢測波長為269 nm，流動相為乙腈-水(6∶94)，在此條件下，樣品具有更好的分離度，保留時間適宜。

關(guān)于水楊苷的定值研究，國內(nèi)報道較少，本研究采用對提取純化的水楊苷進行熔點測定、比旋度測定、元素分析、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜鑒別等方法，對其結(jié)構(gòu)進行了系統(tǒng)確證，表明所分離純化的化學(xué)物質(zhì)為水楊苷；同時，本研究采用紫外檢測器對水楊苷純度進行測定，確保純度達到獸藥對照品的要求。

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(編輯：侯向輝)

Preparation Process of Salicin Reference Substance

FANG Chun-lin1，WU Xue-yuan2，YANG Hai-han2，LI Chao2，TANG Hua-qiao2

(1．ChengduAgriculturalCollege，Chengdu611130，China；2．ChengduQianKunVeterinaryPharmaceuticalCoLtd，Chengdu611130，China)

The present study was performed to extract and separate the salicin from the bark of white willow to prepare the purified salicin reference substance. The salicin was extracted with the macroporous rein separation, N-butyl alcohol extraction and recrystallized method. The purified salicin was identified by testing the melting point and specific rotation, elemental analysis, infrared spectrum, liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum. The purity of salicin was measured by HPLC-UV. The results indicated that content of extracted salicin reference substance is about 99.19% and the purity is more than 99%, which meet the requirement of traditional Chinese medicine reference standards (for determination use).

white willow bark; salicin; extraction; reference substance

房春林，博士，副研究員，從事新獸藥研發(fā)及動物疫病防治。E-mail：fangchunlin05@126.com

2016-05-18

A

1002-1280 (2016) 07-0025-05

S859.79