不同途徑移植臍帶血干細胞對兔2型糖尿病的療效觀察

丁海霞 王富軍 黃曉偉 劉貝 杜亞萍 齊會卿

·論著·

不同途徑移植臍帶血干細胞對兔2型糖尿病的療效觀察

丁海霞 王富軍 黃曉偉 劉貝 杜亞萍 齊會卿

目的 觀察不同途徑移植臍帶血干細胞對兔2型糖尿病的治療效果。方法 30只新西蘭白兔，雌雄各半，制備2型糖尿病模型，隨機分成5組，其中6只在兔的胰腺內注射臍帶血干細胞5×105個（A組），6只向胰腺背動脈內注入臍帶血干細胞5×105個（B組），6只經耳緣靜脈輸注臍帶血干細胞5×105個（C組），6只在腹腔內多處注入臍帶血干細胞5×105個（D組），其余6只向腹腔內注射相同體積的PBS液作為對照組（E組）。HE染色觀察胰腺組織形態(tài)學變化。以上5組白兔均培養(yǎng)觀察4周，每天監(jiān)測白兔血糖，每周測血漿胰島素水平，采用單因素方差分析和t檢驗對血糖值及胰島素水平進行統(tǒng)計分析。結果 A組及B組在移植后血糖逐漸下降，胰島素水平逐漸上升，第4周末，血糖降至（6.80±0.64）mmol/L和（6.78±0.57）mmol/L，胰島素水平逐漸回到正常分別為（25.60±1.47）mU/L和（25.55±1.52）mU/L，與E組（21.77±2.70）mmol/L和（3.80±0.41）mU/L比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01）。而C組血糖較前下降，至第4周末血糖及胰島素均未回正常水平，分別為（9.97±1.19）mmol/L和（15.82±1.05）mU/L，D組仍維持高血糖狀態(tài)，血糖水平為（21.00±1.99）mmol/L，胰島素水平無明顯變化（3.77±0.31）mU/L，與E組（21.77±2.70）mmol/L和（3.80±0.41）mU/L比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05）。移植后4周A、B兩組胰腺組織形態(tài)得到明顯改善，C組部分改善，D組無明顯改善。結論 將臍帶血干細胞在胰腺、胰腺背動脈注射及耳緣靜脈輸注進行移植，可以明顯降低血糖，增加胰島素分泌量，其中，胰腺和胰腺背動脈注射效果優(yōu)于耳緣靜脈輸注，腹腔內移植無明顯效果。

臍血干細胞移植； 糖尿病，2型； 治療結果

近年來，糖尿病的發(fā)病率逐年增加，需要長期口服藥物或注射胰島素控制血糖，而人臍帶血干細胞因其可分化為胰島β細胞分泌胰島素[1]使得其在糖尿病治療中的效果備受關注，目前已有25 000多例臨床移植成功的案例[2]。與骨髓干細胞和外周血干細胞相比，臍帶血干細胞具有來源廣泛、免疫源性低、增殖能力強等特點[3-4]，因此已廣泛應用于臨床治療糖尿病、神經系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病及其它少見疾病，均取得了良好的治療效果[5]。

目前臨床上臍帶血干細胞移植途徑主要有靜脈輸注、胰腺背動脈注射或兩種方法聯(lián)合移植，而腹腔注射、胰腺實質注射目前臨床尚無應用，究竟哪種移植途徑效果更好，文獻少有報道。徐谷根等[6]報道了臍帶血干細胞胰腺實質及胰腺背動脈注射的效果比較，但缺乏靜脈輸注法的效果觀察。

本文對上述不同移植方法進行了療效對比，試圖尋找一種簡便、經濟、高效的移植方法，為臨床臍帶血干細胞移植治療糖尿病提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料及試劑

4周齡新西蘭健康大白兔30只（雌雄各半，河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供），體質量（2.3± 0.5）kg。淋巴細胞分離液由天津顥陽公司（密度為1.077 g/m1）提供，血糖測定試劑盒由保定長城臨床試劑公司提供，血糖監(jiān)測采用羅氏血糖儀，胰島素ELISA試劑盒由Mercodia公司提供，蘇木素一伊紅購自北京中杉金橋公司。

二、研究方法

1.人臍帶血干細胞混懸液的制備：臍血由石家莊市婦產醫(yī)院提供，來源于足月分娩的健康產婦，乙肝、艾滋、梅毒等檢測均呈陰性，產婦及其家屬均簽署知情同意書，實驗方案經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。取新鮮臍血（6 h內用畢），用PBS液（phosphate buffer solution，磷酸鹽緩沖液，Nacl 8 g，Na2HPO41.44 g，Kcl 0.2 g，KH2PO40.24 g，溶于1 000 ml去離子水中，高壓滅菌，保存于4℃的冰箱備用，pH值7.40）等倍稀釋后置于50 ml離心管中，按1∶1比例加入人淋巴細胞分離液上，4℃，離心半徑5 cm，2 000 r/min，離心20 min后，臍血分5層，中間白膜層即為單個核細胞。用移液器小心吸取富含單個核細胞的混懸液放入另一離心管內，4℃，離心半徑5 cm，1 000 r/min離心15 min，PBS洗滌3次。用低糖DMEM培養(yǎng)液懸浮，計數(shù)細胞濃度為5× 105/ml。人臍帶血干細胞混懸液制備成功。

2.兔2型糖尿病模型的制備：30只新西蘭白兔基礎飼料適應性喂養(yǎng)1周，給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，高脂高糖飼料配方：37％蔗糖、5％豬油、53％基礎飼料。第9周所有動物禁食16 h（不禁水），經耳緣靜脈1次快速注射鏈脲佐菌素[（streptozocin，STZ）Sigma公司]，與0.1 mmol/L、pH值4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成濃度為2％的STZ溶液）60 mg/kg，于STZ造模后第1周、第2周分別空腹采血1次。采血后及時分離血清，測定空腹血糖，以空腹血糖≥11.0 mmol/L為2型糖尿病造模成功。

3.臍帶血干細胞移植術：30只2型糖尿病白兔隨機分成5組，其中6只在兔的胰腺內注射臍帶血干細胞懸液1 ml，濃度為5×105個/ml（A組），6只向胰腺背動脈內注入臍帶血干細胞懸液1 ml，濃度為5×105個/ml（B組），6只經耳緣靜脈輸注臍帶血干細胞懸液1 ml，濃度為5×105個/ml（C組），6只在腹腔內多處注入臍帶血干細胞懸液1 ml，濃度為5×105個/ml（D組），其余6只向腹腔內注射相同體積的PBS液作為對照組（E組）。以上5組白兔均培養(yǎng)觀察4周，每天監(jiān)測白兔血糖，每周測血漿胰島素水平，采血及血糖監(jiān)測時間均為夜間空腹10 h后次日晨8點。

4.組織形態(tài)學觀察：采血結束后將白兔處死留取胰腺組織，經固定、沖洗、脫水、浸染、包埋、切片，行HE染色，光鏡下觀察各組白兔胰腺組織形態(tài)。

三、統(tǒng)計學分析方法

應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件分析，血糖和胰島素水平用± s描述，組間比較采用單因素方差分析，組內治療前后比較采用配對t檢驗。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、各組白兔移植前后血糖及胰島素水平的動態(tài)比較

A組及B組在移植后血糖逐漸下降，胰島素水平逐漸上升，第4周末，血糖和胰島素水平逐漸降到正常，與E組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。而C組血糖較前下降，胰島素水平較前升高，但至第4周末血糖及胰島素均未回復正常水平，D組仍維持高血糖狀態(tài)，血糖和胰島素水平較前無明顯變化，與E組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05，表1、2）。

二、各組白兔移植后4周胰腺組織HE染色形態(tài)比較

分組治療4周后取白兔胰腺組織顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，A組及B組胰腺組織形態(tài)較清晰，結構比較完整，較多的胰島細胞團，無明顯淋巴細胞浸潤；C組與上述兩組比較形態(tài)偏紊亂，較少的淋巴細胞浸潤；D組與E組比較形態(tài)無明顯差異，可見胰腺組織胰島結構萎縮，形態(tài)紊亂，僅見少許胰島細胞團，并伴淋巴細胞浸潤（圖1）。

討 論

表1 移植前后各組白兔血糖水平的變化（n = 6，mmol/L，± s）

表1 移植前后各組白兔血糖水平的變化（n = 6，mmol/L，± s）

注：A組為胰腺內注射組,B組為胰腺背動脈注射組,C組為耳緣靜脈輸注組,D組為腹腔注射組,E組為對照組。與A組相比aP ＜ 0.01，與B組相比bP ＜ 0.01, 與C組相比cP ＜ 0.01，與D組相比dP ＜ 0.01

分組移植前移植后1周移植后4周F值P值A組21.73±1.65 11.45±1.97 6.80±0.64 149.953＜ 0.01 B組21.55±1.78 11.50±1.88 6.78±0.57 145.181＜ 0.01 C組21.43±2.16 14.02±1.13abd9.97±1.19abd82.488＜ 0.01 D組21.03±2.01 21.03±2.03abc21.00±1.99abc0.001＞ 0.05 E組21.72±2.76 21.72±2.75abc21.77±2.70abc0.001＞ 0.05 F值 0.110 37.861 127.289 P值0.978 0.000 0.000

表2 移植前后各組白兔胰島素水平的變化（n = 6，mU/L，± s）

表2 移植前后各組白兔胰島素水平的變化（n = 6，mU/L，± s）

注：A組為胰腺內注射組,B組為胰腺背動脈注射組,C組為耳緣靜脈輸注組,D組為腹腔注射組,E組為對照組。與A組相比aP ＜ 0.01，與B組相比bP ＜ 0.01，與C組相比cP ＜ 0.01，與D組相比dP ＜ 0.01

分組移植前移植后1周移植后4周F值P值A 組3.67±0.41 18.02±1.92 25.60±1.47 372.478＜ 0.01 B組3.65±0.39 18.12±1.94 25.55±1.52 357.783＜ 0.01 C組3.77±0.33 10.96±1.28abd15.82±1.05abd232.092＜ 0.01 D組3.83±0.36 3.83±0.34abc3.77±0.31abc0.078＞ 0.05 E組3.70±0.39 3.76±0.34abc3.80±0.41abc0.107＞ 0.05 F值0.241 163.669 613.361 P值0.912 0.000 0.000

臍帶血是指胎兒娩出后殘留在臍帶和胎盤中的血液。新生兒臍帶血中含有豐富的造血干細胞，研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血干細胞可以促進1型糖尿病卒中小鼠神經功能的恢復[7]，移植后小鼠胰島中有10％ ～20％的胰島素陽性細胞可檢測出造血干細胞標志物，說明造血干細胞與胰島β細胞再生存在密切的關系[8]。而糖尿病是由于患者體內胰島素缺乏所致，因此有學者利用臍帶血干細胞移植來治療糖尿病，取得了不錯的療效[9-10]，移植臍帶血干細胞治療2型糖尿病的機制可能有如下幾種：（1）使臍帶血干細胞到達胰腺微環(huán)境，受到定向的誘導從而分化為胰島β細胞，增加其數(shù)量，最大限度的恢復和挽救胰島功能；（2）改善胰島微環(huán)境，促進胰島細胞的再生；（3）使糖尿病并發(fā)癥得到有效改善和控制[11]，陳頻等[12]的研究顯示臍帶間充質干細胞多次足量序貫輸注干預模式對2型糖尿病大鼠糖代謝和胰島分泌功能具有良好的改善作用，其機制可能與其下調TLR4/NF-kB炎癥通路抑制胰島β細胞凋亡有關，進一步研究發(fā)現(xiàn)干細胞抑制胰島β細胞凋亡的作用更勝于其促進胰島β細胞增殖[13]，但文獻報道移植途徑各有不同，缺乏對不同移植途徑的對比，因此尋找一種方便快速、創(chuàng)傷小、效果好的方法成為眾多醫(yī)生奮斗的目標。

本研究采用兔制作糖尿病模型，因為兔是一種體型適中的動物，在給藥、取血、抗病性等方面明顯優(yōu)于大鼠，便于開展糖尿病病理、治療及相關研究。而高脂高糖喂養(yǎng)加注射小劑量STZ能復制出具有胰島素抵抗、高血糖、高血脂等接近2型糖尿病臨床特點的兔動物模型[14]，利于后續(xù)試驗的開展。

在本研究中發(fā)現(xiàn)胰腺內注射組及胰腺背動脈注射組在移植后血糖逐漸下降，胰島素水平逐漸上升，第4周末，血糖和胰島素水平逐漸降到正常。而經耳緣靜脈輸注組血糖較前下降，胰島素水平較前升高，但至第4周末血糖及胰島素均未回復正常水平，經腹腔注射組仍維持高血糖狀態(tài)，血糖和胰島素水平較前無明顯變化，上述結果提示，靜脈輸注有效，與胰島及胰腺背動脈局部應用相比效果較差，這與白兔胰腺組織HE染色結果相一致，如果延長觀察時間或者多次輸注或者與胰島局部注射聯(lián)合效果可能更好，但尚待進一步研究。試驗中應用的有效量為5×105個，在今后的研究中將對不同劑量干細胞注射效果進行對比觀察。

綜上所述，本文對比了臍帶血干細胞不同移植途徑對白兔糖尿病的治療作用，胰腺注射及胰腺背動脈注射效果最佳，但若應用于人創(chuàng)傷大、費用高，而靜脈注射法簡單、有效，可通過多次注射、延長治療時間增強治療效果，腹腔內注射無明顯效果，為臨床臍帶血干細胞移植提供了理論依據(jù)。

圖1 光學顯微鏡下觀察各組白兔移植后4周胰腺組織形態(tài) （HE染色×200）

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Effects of different route of umbilical cord blood stem cells transplantation in treatment of rabbits with type 2 diabetes mellitus

Ding Haixia, Wang Fujun, Huang Xiaowei, Liu Bei, Du Yaping, Qi Huiqing. Department of Endocrinology, the Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China

Wang Fujun, Email:wangfujun139@126.com

Objective To evaluate the therapeutic effects of different routes of umbilical cord blood stem cell (UCSCs) transplantation on type 2 diabetes mellitus in rabbits. Methods Thirty New Zealand white rabbits with type 2 diabetes were randomly divided into five groups. In the treatment groups, 5×105UCSCs were given via different routes∶ in pancreas in Group A, via dorsal pancreatic artery in Group B, via ear marginal vein in Group C, and in abdominal cavity in Group D. In Group E, the same volume of PBS was given via intraperitoneal injectionf ana served as control. The five groups were evaluated for 4 weeks, and the blood glucose was monitored every day, plasma insulin levels were measured every week. Pancreatic tissues were evaluated. Results In Group A and Group B, the blood glucose levels were decreased gradually, and the levels of insulin increased gradually, they returned to normal in the fourth week, as（6.80±0.64）mmol/L and (6.78±0.57)mmol/L, (25.60±1.47) mU/L and (25.55±1.52) mU/L, compared with the control group (21.77±2.70) mmol/L and (3.80±0.41) mU/L (P ＜ 0.01). The blood glucose and insulin levels were changed in Group C,and the levels of bood glucose and insulin were not returned to normal level at fourth weeks, the number were(9.97±1.19) mmol/L and (15.82±1.05) mU/L. The blood glucose level and insulin level were not significantly changed in Group D and Group E(P ＞ 0.05). The islet architecture was improved and cell unite numbers were significantly increased in A and B group, but no changes were fond in D group. Conclusions Transplantation of umbilical cord blood stem cells in the pancreas, pancreatic dorsal artery and ear vein infusion can significantly reduce blood glucose, increase insulin secretion, better than the abdominal cavity transplantation.

Umbilical cord blood stem cell； Transplantation； Diabetes mellitus, Type 2 ； Treatment outcome

2016-06-15）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.002

河北省衛(wèi)生廳課題（20150760）

050011 石家莊，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院內分泌科

王富軍，Email：wangfujun139@126.com

丁海霞，王富軍，黃曉偉，等. 臍帶血干細胞不同途徑移植對兔2型糖尿病的療效觀察[J/CD].中華細胞與干細胞雜志∶電子版, 2016, 6(6)∶334-338.