響應(yīng)面法優(yōu)化山丹鱗莖總黃酮提取工藝的研究

張 昊，邵 青，賀曉龍，王延峰

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心， 陜西 延安 716000)

響應(yīng)面法優(yōu)化山丹鱗莖總黃酮提取工藝的研究

張 昊，邵 青，賀曉龍，王延峰*

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心， 陜西 延安 716000)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化山丹鱗莖總黃酮提取工藝條件。結(jié)果表明，山丹鱗莖總黃酮提取最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)73%、料液比32∶1(mL/g)、回流溫度69 ℃、回流時(shí)間120 min。經(jīng)證明，總黃酮含量試驗(yàn)值(4.685 mg/g)與預(yù)測(cè)值(4.729 mg/g)基本一致，RSD為0.661%，表明所得工藝參數(shù)可靠。

山丹； 總黃酮； 乙醇回流提?。?響應(yīng)面法

山丹(Liliumpumilum)又稱細(xì)葉百合，是百合科百合屬多年生草本植物。鱗莖可入藥，用于治療陰虛燥咳，勞嗽咳血，虛煩驚悸，失眠多夢(mèng)，精神恍惚[1]。黃酮類化合物是一種廣泛存在于植物中的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性的多酚類化合物[2]，具有擴(kuò)張血管、防御病原體、抗氧化、抗炎、抗癌、增加免疫力及調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多種生物活性[3]。目前關(guān)于黃酮的提取方法報(bào)道較多，包括有機(jī)溶劑提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取、堿提酸沉、超臨界提取等[4-8]，而有關(guān)山丹鱗莖中總黃酮的提取鮮有報(bào)道。鑒于此，對(duì)山丹鱗莖總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究，采用乙醇回流提取法并通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到其最佳提取工藝，以期對(duì)山丹資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 山丹鱗莖由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2 試驗(yàn)藥品 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司)、乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備 UV-2600紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)、N-1200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛浪儀器有限公司)、AUY220電子天平(日本島津公司)、SHB-3A循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)、HH-6B恒溫水浴鍋(江蘇常州國(guó)華電器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料處理 將山丹鱗莖清洗干凈，晾干后粉碎過孔徑為0.3 mm的篩，裝入廣口瓶密封保存。

1.2.2 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以蘆丁為標(biāo)品，采用NaNO3-Al(NO3)3比色法測(cè)定在510 nm處的吸光值[9]，利用UVprobe軟件生成蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=13.064 18x-0.004 11，R2=0.999 42。

1.2.3 山丹鱗莖總黃酮提取含量的測(cè)定 設(shè)置回流條件后依次進(jìn)行提取、抽濾、旋蒸、定容，按1.2.2方法測(cè)量吸光度并計(jì)算山丹鱗莖中黃酮的含量，其計(jì)算公式為[10]：提取含量(mg/g)=CV/m，式中，C為提取液的總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，V為提取液的體積(mL)，m為稱取試驗(yàn)材料的質(zhì)量(g)。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱取試驗(yàn)材料10 g，分別固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為30∶1(mL/g，下同)、回流溫度為70 ℃及回流時(shí)間為120 min中的3個(gè)因素，分別考察第4個(gè)因素中乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)、回流溫度(50、60、70、80、90 ℃)、回流時(shí)間(60、90、120、150、180 min)對(duì)山丹鱗莖中總黃酮提取含量的影響，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了解因素之間的相互作用對(duì)山丹鱗莖總黃酮提取的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)(表1)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，總黃酮提取含量最高。黃酮類物質(zhì)的極性范圍很廣，依據(jù)相似相溶原則，提取液極性與黃酮類物質(zhì)極性臨近時(shí)有助于黃酮類物質(zhì)最大限度地析出。乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)可能與黃酮類物質(zhì)極性最為接近，因此使得總黃酮最大程度地析出。故初步設(shè)70%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取含量的影響

2.1.2 料液比 由圖2可知，當(dāng)料液比為30∶1時(shí)，總黃酮提取含量最高，然后再增加提取液的量也不會(huì)顯著影響總黃酮的提取含量，其原因可能是提取溶劑與提取材料的邊界層濃度差變小，物質(zhì)擴(kuò)散程度到達(dá)了平衡狀態(tài)[11]。料液比為30∶1時(shí)，總黃酮在乙醇溶液的擴(kuò)散程度可能已經(jīng)平衡，考慮成本等因素初步選取30∶1為最佳料液比。

圖2 料液比對(duì)總黃酮提取含量的影響

2.1.3 回流溫度 由圖3可知，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)總黃酮提取含量最高。70 ℃之前由于溫度的升高使提取速率加大，相同時(shí)間內(nèi)的提取含量上升；溫度超過70 ℃時(shí)提取含量有所降低，可能是某些黃酮類物質(zhì)在溫度過高時(shí)發(fā)生質(zhì)變。故初步設(shè)70 ℃為最佳回流溫度。

圖3 回流溫度對(duì)總黃酮提取含量的影響

2.1.4 回流時(shí)間 由圖4可知，回流時(shí)間為120 min時(shí)，總黃酮提取含量最高。超過120 min后總黃酮含量下降?？赡苁且呀?jīng)提取出來的一部分黃酮被分解，亦或是時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)提取出更多非黃酮物質(zhì)。故初步設(shè)120 min為最佳回流時(shí)間。

圖4 回流時(shí)間對(duì)總黃酮提取含量的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化山丹鱗莖總黃酮提取工藝

2.2.1 試驗(yàn)方案及回歸方程 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮回流溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、回流時(shí)間4個(gè)因素對(duì)山丹鱗莖總黃酮提取的影響設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)，設(shè)計(jì)如表2。并根據(jù)Box-Behnken中心組合原理[12]對(duì)其進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：R=-74.178 60+1.1377 5A+0.686 96B+0.228 16C+0.137 98D+0.000 377 5AB+0.000 267 5AC-0.000 075AD-0.000 855BC+0.000 09BD+0.000 265 833CD-0.007 918 08A2-0.005 024 33B2-0.003 863 08C2-0.000 586 593D2。

由表3可知，對(duì)山丹鱗莖總黃酮提取所建立的

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

注：*、**分別表示在0.05、 0.01 水平上差異顯著。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析 響應(yīng)曲面反映了任意2個(gè)因素取零點(diǎn)水平時(shí)，其他2個(gè)因素的相互作用對(duì)山丹鱗莖總黃酮提取含量的影響，可以找到它們?cè)谔崛∵^程中相互影響的關(guān)系。圖5—10直觀地反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、回流溫度對(duì)總黃酮的提取有著極顯著的影響，表現(xiàn)為曲線相對(duì)較陡，而回流時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響為不顯著，表現(xiàn)為曲線較為平滑，隨其數(shù)值的上升或下降響應(yīng)值變化較小，與表3結(jié)果相吻合。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)總黃酮提取含量影響的響應(yīng)曲面

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和回流溫度對(duì)總黃酮提取含量影響的響應(yīng)曲面

2.2.3 最佳工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn) 用Design-Expert 8.0.6軟件得出山丹鱗莖總黃酮的最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)73.39%，料液比31.58∶1，回流溫度68.64 ℃，回流時(shí)間119.39 min?？紤]實(shí)際的可操作性將最佳工藝設(shè)置為乙醇體積分?jǐn)?shù)73%，料液比32∶1，回流溫度69 ℃，回流時(shí)間120 min。在此條件下做3次驗(yàn)證試驗(yàn)，最大值(4.685 mg/g)與預(yù)測(cè)值(4.729 mg/g)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.661%，表明該模型可靠。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和回流時(shí)間對(duì)總黃酮提取含量影響的響應(yīng)曲面

圖8 液料比和回流溫度對(duì)總黃酮提取含量影響的響應(yīng)曲面

圖9 液料比和回流時(shí)間對(duì)總黃酮提取含量影響的響應(yīng)曲面

圖10 回流溫度和回流時(shí)間對(duì)總黃酮提取含量影響的響應(yīng)曲面

3 結(jié)論與討論

響應(yīng)面分析法解決了正交設(shè)計(jì)只能處理離散的水平值而不能找出整個(gè)區(qū)域內(nèi)因素的最佳組合和最優(yōu)值的問題，是研究幾種因素及其交相作用的回歸分析方法[14]。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過應(yīng)用響應(yīng)面法得到山丹鱗莖總黃酮的最佳提取工藝,實(shí)際的提取含量與薛長(zhǎng)暉等在山丹葉[15]、山丹莖[16]中提取的黃酮含量存在差異，說明山丹不同部位中的黃酮含量可能存在差異。本試驗(yàn)的總黃酮提取含量略高于王潤(rùn)豐[17]用超聲波提取法提取的含量，可能是由于采用乙醇回流提取山丹鱗莖總黃酮時(shí)反應(yīng)比較平緩，對(duì)黃酮類化合物結(jié)構(gòu)的破壞較小，提取含量較高。其不足是提取時(shí)間長(zhǎng)、提取成本大，而一些新興的提取技術(shù)，如超聲波提取法、微波輔助浸提取等，它們能夠縮短提取所需的時(shí)間，卻存在破壞提取物中成分的可能性。本試驗(yàn)通過響應(yīng)面法優(yōu)化了山丹鱗莖中總黃酮的提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)73%，料液比32∶1，回流溫度69 ℃，回流時(shí)間120 min，為連續(xù)性提取山丹鱗莖中總黃酮提供一定參考。

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Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids fromLiliumpumilumbulb Using Response Surface Methodology

ZHANG Hao,SHAO Qing,HE Xiaolong,WANG Yanfeng*

(College of Life Science,Yan’an University/Shaanxi Province Engineering Research Center of Regional Biological Resources Conservation and Utilization,Yan’an 716000,China)

The method of response surface analysis was adopted to optimize the extraction conditions of total flavonoids formLiliumpumilumbulb on the basis of single-factor experiment.The results showed that the optimum technological conditions were ethanol concentration of 73%,material-liquid ratio of 32∶1,reflux temperature of 69 ℃ and reflux time of 120 min.Under such conditions,the actual value of total flavonoids extracted was 4.685 mg/g,which was basically coincident with the predicted value 4.729 mg/g.RSDwas 0.661%,indicating that the optimum process conditions were reliable.

Liliumpumilum; total flavonoids; reflux extraction with ethanol; response surface methodology

2015-09-15

陜西省高水平大學(xué)建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(生物學(xué)2012SXTS06);陜西省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2012K01-02);延安市科技局項(xiàng)目(2012Ks-13)

張 昊(1987-)，男，陜西涇陽人，在讀碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。 E-mail:15191167658@sohu.com

*通訊作者：王延峰(1970-)，男，陜西丹鳳人，教授，博士，主要從事生物資源開發(fā)利用、園藝農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)業(yè)化技術(shù)研究。 E-mail:wyfcollege@sohu.com

S567.23

A

1004-3268(2016)03-0152-05