不同產(chǎn)地黃硬皮馬勃的紅外光譜鑒別方法研究

呂偉奇，張 霽，趙艷麗，王元忠*

(1.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，云南 昆明 650200)

不同產(chǎn)地黃硬皮馬勃的紅外光譜鑒別方法研究

呂偉奇1,2，張 霽2，趙艷麗2，王元忠2*

(1.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，云南 昆明 650200)

黃硬皮馬勃(SclerodermaflavidumEll.et EV.)主要生長在我國南方地區(qū)，有食用和藥用價值。利用紅外技術(shù)對其進(jìn)行產(chǎn)地鑒別，為黃硬皮馬勃的資源鑒別提供基礎(chǔ)分析方法和理論依據(jù)。利用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)儀采集4個不同產(chǎn)地共40個黃硬皮馬勃樣本的紅外光譜，每個樣本平行掃描3次，取平均值。隨機(jī)選擇12個樣本作為驗證集，其余作為校正集，采用1 800～500 cm-1波段的光譜數(shù)據(jù)，對比多種預(yù)處理方法，選擇最佳預(yù)處理方法建立模型并進(jìn)行判別分析(discriminant analysis，DA)。結(jié)果表明，預(yù)處理方法ND(7∶3)+SD+MSC(ND為諾里斯導(dǎo)數(shù)平滑，SD為二階導(dǎo)數(shù)，MSC為多元散射校正)構(gòu)建的判別模型性能最佳，驗證集樣本的分類準(zhǔn)確率和校正集樣本的回判準(zhǔn)確率均達(dá)到100%，模型鑒別效果良好，可靠性高。傅里葉變換紅外光譜法結(jié)合判別分析，能有效鑒別不同產(chǎn)地黃硬皮馬勃。

黃硬皮馬勃； 產(chǎn)地鑒別； 傅里葉變換紅外光譜； 判別分析

黃硬皮馬勃(SclerodermaflavidumEll.et EV.)屬于硬皮馬勃目硬皮馬勃科真菌，分布于云南、福建、廣西、廣東、香港、海南等地[1]，夏秋季群生或單生于闊葉林地和林緣山坡上，與櫟、馬尾松形成外生菌根。此菌有輕微毒性，幼時可食用，味道鮮美，成熟后孢粉有較好的抑菌消炎作用[2]，具有成為高效抗菌藥物原料的潛力。

長久以來，人類都在與病原菌導(dǎo)致的疾病做抗?fàn)?，抗菌藥物?shù)量和品質(zhì)的需求不斷提高。目前市場上抗菌類藥物大多為抗生素[3]和化學(xué)合成藥[4]，這2類藥物治療效果明顯，卻易產(chǎn)生耐藥性等副作用[5]，給人體帶來較大傷害[6]，新型抗菌藥研制引起廣泛關(guān)注[7]。黃硬皮馬勃等真菌含有天然抗菌效果的活性物質(zhì)[8]，對研制低副作用抗菌藥物有重要意義。研究表明,大部分真菌物種的品質(zhì)與其產(chǎn)地密切相關(guān)[9]，進(jìn)行黃硬皮馬勃的產(chǎn)地鑒別，有助于篩選和開發(fā)優(yōu)質(zhì)黃硬皮馬勃資源，為相關(guān)抗菌藥物的研發(fā)提供選材方面的參考。

傅里葉變換紅外光譜法作為常用的材料檢測方法，通過紅外光譜掃描，使樣本分子中基團(tuán)或化學(xué)鍵吸收能量產(chǎn)生振動，形成振動吸收光譜用于鑒別分析[10]。此方法具有靈敏、無損、樣本用量少等特點(diǎn)[11]，廣泛應(yīng)用于中藥分析[12-13]、酒類分析[14-15]、農(nóng)產(chǎn)品分析[16-17]等領(lǐng)域。

采自不同產(chǎn)地的黃硬皮馬勃，外觀無明顯差異，不易判斷產(chǎn)地來源，需要有效鑒別手段。目前，尚未見黃硬皮馬勃產(chǎn)地鑒別方面的報道。為了探尋一種能夠快速、準(zhǔn)確鑒別黃硬皮馬勃產(chǎn)地的方法，本研究采用傅里葉變換紅外光譜法，采集云南4個地區(qū)黃硬皮馬勃的紅外圖譜，結(jié)合判別分析[18]處理光譜數(shù)據(jù)，提取有效信息，輔助產(chǎn)地鑒別。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用的馬勃樣本于2014年采自云南省玉溪市(表1)，經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉鴻高教授鑒定為黃硬皮馬勃。

表1 材料的來源和數(shù)量

1.2 試驗儀器及試劑

Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Perkin Elmer公司)，配備DTGS檢測器，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描信號累加16次；FW-100型高速萬能粉碎機(jī)(天津市華鑫儀器廠)；0.250 mm孔徑標(biāo)準(zhǔn)篩(浙江上虞市道墟五四儀器廠)；YP-2型壓片機(jī)(上海市山岳科學(xué)儀器有限公司)；XS125A型電子分析天平(瑞士Precisa公司)；溴化鉀(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本預(yù)處理 將樣本在60 ℃下干燥至恒定質(zhì)量，粉碎后過0.250 mm孔徑標(biāo)準(zhǔn)篩，放入自封袋儲存?zhèn)溆茫鳟a(chǎn)地樣本隨機(jī)編號見表1。

1.3.2 紅外光譜采集 稱取100 mg溴化鉀壓片，掃描后作為背景去除干擾信息。1～40號黃硬皮馬勃樣本在干燥箱中干燥24 h，依次精密稱取1.0 mg放入瑪瑙研缽中研細(xì)，按1∶100的比例加入溴化鉀研磨均勻，壓制成均勻透明的樣本薄片，掃描薄片，采集樣本的紅外光譜，每個樣本平行掃描3次，取平均值作為該樣本原始光譜。

1.4 圖譜優(yōu)化處理

利用Omnic 8.0軟件對樣本光譜圖進(jìn)行吸光度轉(zhuǎn)換、自動基線校正、縱坐標(biāo)歸一化等優(yōu)化處理。

1.5 建立判別模型

圖譜優(yōu)化處理后，數(shù)據(jù)導(dǎo)入TQ 8.6軟件，選擇合適波段與最佳預(yù)處理方法建立判別模型進(jìn)行分析。判別模型以每個產(chǎn)地材料中任意3個樣本作為驗證集，其余28個樣本作為校正集(表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 平均光譜及其特征分析

由圖1可以看出，黃硬皮馬勃4個產(chǎn)地的平均紅外光譜無明顯差異，在3 347、2 926、1 637、1 393、1 248、1 076、1 041 cm-17個波長附近都有較強(qiáng)吸收峰，峰形基本一致。3 347 cm-1附近吸收峰峰形平緩，由阿洛糖醇等醇類化合物[19]中醇羥基的O-H鍵伸縮振動形成；2 926 cm-1附近吸收峰由烷烴結(jié)構(gòu)中的C-H鍵反對稱伸縮振動形成；1 637 cm-1附近吸收峰由烯烴結(jié)構(gòu)中的C=C鍵伸縮振動形成；1 393 cm-1附近吸收峰由芳香環(huán)C=C鍵的伸縮振動形成；醇類化合物中C-OH鍵伸縮振動與COH面內(nèi)彎曲振動發(fā)生耦合，形成1 248 cm-1附近吸收峰，同時，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的存在導(dǎo)致1 076、1 041 cm-1附近雙吸收峰[10]。上述分析表明黃硬皮馬勃主要成分為多糖類物質(zhì)。結(jié)合圖1，顯示4個產(chǎn)地黃硬皮馬勃紅外光譜圖波形相似，直接觀察無法達(dá)到產(chǎn)地鑒別的要求。

a.玉溪市紅塔區(qū)； b.玉溪市九溪鎮(zhèn)；c.玉溪市峨山雙江鎮(zhèn)； d.玉溪市大營街鎮(zhèn)圖1 不同產(chǎn)地黃硬皮馬勃的光譜圖

2.2 判別分析

判別分析利用已知樣本的光譜數(shù)據(jù)，建立判別分析模型，可以對未知樣本快速準(zhǔn)確地進(jìn)行分類鑒別。為建立高性能模型，需要篩選建模波段，對樣本光譜進(jìn)行預(yù)處理，以提取有效的建模信息。

樣本紅外圖譜總體波段包括4 000～400 cm-1，含有較多復(fù)雜數(shù)據(jù)點(diǎn)，容易造成干擾，需要選擇合適波段的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[20]。由圖1和圖2可以看出，光譜圖在波段1 800～500 cm-1波形起伏較大，圖譜間差異表現(xiàn)明顯，因此選擇此波段光譜構(gòu)建判別模型。

圖2 一階導(dǎo)數(shù)光譜圖

將Omnic 8.0軟件優(yōu)化后的校正集樣本圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入TQ 8.6軟件，按不同預(yù)處理方法構(gòu)建模型，比較模型性能以獲得最佳的預(yù)處理方法(表2)。采用不同預(yù)處理方法構(gòu)建的模型對驗證集樣本進(jìn)行判別，結(jié)果顯示，當(dāng)建模主成分?jǐn)?shù)量在一定范圍時，各模型中驗證集樣本的分類準(zhǔn)確率和校正集樣本的回判準(zhǔn)確率都達(dá)到100%。

注：ND為諾里斯導(dǎo)數(shù)平滑(norris derivative smoothing)；FD為一階導(dǎo)數(shù)(first derivative)；SD為二階導(dǎo)數(shù)(second derivative)；SNV為標(biāo)準(zhǔn)歸一化(standard normal variate)；MSC為多元散射校正(multiplicative signal correction)。

相同預(yù)處理方法下，比較鑒別無誤時各主成分?jǐn)?shù)構(gòu)建模型的性能，選擇性能最佳的模型使用的主成分?jǐn)?shù)作為最佳主成分?jǐn)?shù)。不同預(yù)處理方法下，比較最佳主成分?jǐn)?shù)構(gòu)建模型的性能。結(jié)果顯示，選用預(yù)處理方法ND(7∶3)+SD+MSC，以14個主成分建立模型，與其他方法相比構(gòu)建的模型性能最佳，可靠性高。此處理方法下建模，前14個主成分累積貢獻(xiàn)率為99.6%，可以解釋大部分光譜特征信息。

判別分析建立的模型可以根據(jù)校正集中不同產(chǎn)地黃硬皮馬勃樣本的特征信息構(gòu)建4個類群的距離判別函數(shù)式，計算驗證集各樣本與4個類群的馬氏距離(mahalanobis distance，MD)，馬氏距離是通過數(shù)據(jù)協(xié)方差距離來計算的樣本與類群的相似度，距離值越小，相似度越大[21]。表3為判別模型依據(jù)馬氏距離得出的鑒別結(jié)果，所列樣本均被準(zhǔn)確鑒別。數(shù)據(jù)顯示，大部分相同類群樣本至同一類群的距離相近，說明相同產(chǎn)地黃硬皮馬勃樣本化學(xué)組分相似度高。第2類群中11、12號樣本與13號樣本到第1、2、3類群距離相差約為1，表明第2產(chǎn)地部分樣本化學(xué)組分與同類群其他樣本有差異，可能是第2產(chǎn)地內(nèi)不同樣本采集環(huán)境差異造成的。

表3 驗證集類別鑒定

3 結(jié)論與討論

傅里葉變換紅外光譜技術(shù)在20世紀(jì)后期的30 a發(fā)展較快，紅外儀器迅速更新?lián)Q代，性能大幅度提高，技術(shù)不斷革新，且得到了大范圍的推廣，可有效應(yīng)用于未知物的定量和定性分析[10]。紅外技術(shù)通過讀取微生物菌體中細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)包括的蛋白質(zhì)、水、脂肪、多糖等成分的化學(xué)鍵振動情況，提供整個微生物的光譜信息[22]。因此，傅里葉變換紅外光譜技術(shù)可以提供含有真菌整體組分的指紋特征圖譜，以不同產(chǎn)地黃硬皮馬勃圖譜為基礎(chǔ)分析差異，可以實現(xiàn)傳統(tǒng)分類方法無法實現(xiàn)的高效鑒別。

通過傅里葉變換紅外光譜法采集4個不同產(chǎn)地黃硬皮馬勃的紅外光譜圖，對全波段圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行特征分析，結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地樣本圖譜波形相似，難以直接辨別。為準(zhǔn)確鑒別樣本產(chǎn)地，采用TQ 8.6軟件，選擇1 800～500 cm-1光譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建判別分析模型。圖譜預(yù)處理方法和建模使用的主成分?jǐn)?shù)對模型性能有影響，需要篩選合適的預(yù)處理方法和主成分?jǐn)?shù)。試驗以諾里斯導(dǎo)數(shù)平滑、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)歸一化、多元散射校正5種圖譜處理方法組合為8種預(yù)處理方法，結(jié)合TQ軟件選擇不同預(yù)處理方法和主成分?jǐn)?shù)構(gòu)建多個模型并對比模型性能。對比發(fā)現(xiàn)，選擇預(yù)處理方法ND(7∶3)+SD+MSC，以14個主成分建立判別分析模型性能最高，驗證集樣本的分類準(zhǔn)確率和校正集樣本的回判準(zhǔn)確率均達(dá)到100%，鑒別效果良好。

本研究表明，判別分析通過提取紅外圖譜主要特征信息，可以有效分析不同樣本圖譜間的差異，準(zhǔn)確鑒別不同產(chǎn)地黃硬皮馬勃。傅里葉變換紅外光譜法和判別分析的結(jié)合，以已知樣本信息建立判別模型判斷未知樣本類群，為鑒別不同產(chǎn)地黃硬皮馬勃提供了一種快速、準(zhǔn)確的產(chǎn)地鑒別方法。此方法對黃硬皮馬勃的產(chǎn)地鑒定具有重要意義，但無法明確不同產(chǎn)地樣本品質(zhì)的優(yōu)劣，需要進(jìn)一步研究。

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Discrimination ofSclerodermaflavidumfrom Different Geographical Origins by Infrared Spectroscopy

Lü Weiqi1,2,ZHANG Ji2,ZHAO Yanli2,WANG Yuanzhong2*

(1.College of Traditional Chinese Medicine,Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China; 2.Institute of Medicinal Plants,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650200,China)

SclerodermaflavidumEll.et EV.which has both medicinal and edible value,is mainly distributed in south China.Discrimination ofS.flavidumfrom different geographical origins by infrared spectroscopy could provide an basic analysis method and theoretical basis for distinguishing its resource.Fourier transform infrared(FTIR) spectroscopy method was used to study 40S.flavidumsamples from four different producing areas.Every sample was scanned for three times to get the average spectrum.Twelve samples were chosen randomly to form the validation set and others were used to build calibration set.According to the contrastive results of different pretreatment methods for the spectra with the range of 1 800—500 cm-1,the best pretreatment method was used to build the discriminant analysis model.The results indicated that the model with pretreatment method ND(7∶3)+SD+MSC was the best.The prediction accuracy of the validation sets and the correct rate of returned classification of calibration set all reached 100%.The model had good effect and high reliability.FTIR combined with discriminant analysis could provide a fast and high-efficiency way to distinguish theS.flavidumwith different geographical origins,effectively.

SclerodermaflavidumEll.et EV; discrimination of geographical origins; fourier transform infrared(FTIR) spectroscopy; discriminant analysis

2015-06-20

國家自然科學(xué)基金項目(31460538)

呂偉奇(1991-)，男，山東聊城人，在讀碩士研究生，研究方向：中藥資源開發(fā)與利用。 E-mail：lvweiqi1991@126.com

*通訊作者：王元忠(1981-)，男，云南怒江人，助理研究員，碩士，主要從事藥用真菌研究。E-mail：boletus@126.com

S567

A

1004-3268(2016)01-0104-05