研究基因沉默途徑的幾種篩選系統(tǒng)概述

陳黃曌，劉延波，余海尤，鄧曉旭，王永芬

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院生物工程學(xué)院，鄭州 450046）

研究基因沉默途徑的幾種篩選系統(tǒng)概述

陳黃曌，劉延波，余海尤，鄧曉旭，王永芬

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院生物工程學(xué)院，鄭州 450046）

在真核生物中，基因表達的表觀遺傳控制，在應(yīng)對病毒入侵、轉(zhuǎn)座子易位和轉(zhuǎn)基因片段插入過程中，發(fā)揮著重要作用。在植物中，轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因的沉默，主要通過轉(zhuǎn)錄基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）或者轉(zhuǎn)錄后基因沉默途徑（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。TGS通常是由轉(zhuǎn)入基因的多拷貝或由轉(zhuǎn)基因片段插入到了染色體的特定區(qū)域引起的，受內(nèi)源基因啟動子啟動的轉(zhuǎn)基因表達，可能會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因及該內(nèi)源基因的沉默，該過程可能通過RNAs介導(dǎo)完成。擬南芥屬雙子葉開花植物，花期較短，且已經(jīng)完成全基因組測序及注釋工作。目前，作為一種模式研究植物，植物表觀遺傳學(xué)研究者利用擬南芥，通過遺傳篩選結(jié)合蛋白和分子生物學(xué)方法，研究DNA甲基化、組蛋白修飾和基因表達調(diào)控的表觀遺傳分子機制，通過構(gòu)建不同的篩選系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，參與到RdDM（RNA-directed DNA methylation）及其它途徑中的新基因，并借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究工具，具體闡明該新發(fā)現(xiàn)基因，在整個甲基化調(diào)控中的作用機理。文章以甲基化調(diào)控為研究對象，對當(dāng)前具有代表性的篩選系統(tǒng)做概括介紹。

DNA甲基化 基因沉默 RdDM 篩選系統(tǒng)

與原核生物不同，真核生物的遺傳信息儲存，在以組蛋白八聚體包裹著DNA組成的核小體中，并以染色質(zhì)形式存在。因此，基因的表達調(diào)控就不可避免地受到DNA和組蛋白表觀遺傳修飾的影響，尤以DNA甲基化修飾最為常見［1］。DNA甲基化是指，在胞嘧啶堿基端添加一個甲基基團。在哺乳動物中，DNA甲基化專一性的發(fā)生在對稱的CG背景下，占到了整個基因組比例的70%～80%；在植物中，DNA甲基化發(fā)生在以下的序列背景：對稱的CG、CHG和不對稱的CHH（H = A T or C）。其中，CG和CHG序列背景下的甲基化，主要是由MET1 和CMT3兩個基因編碼蛋白維持的，而CHH序列背景下的DNA甲基化則由DRM2基因編碼蛋白從頭合成來維持的，與哺乳動物不同，植物中DNA甲基化，主要發(fā)生在轉(zhuǎn)座子和其它DNA重復(fù)序列原件［2］。

植物中DNA甲基化的從頭合成，最初被發(fā)現(xiàn)是由小RNA介導(dǎo)的［3］，目前已被命名為RdDM（RNA指導(dǎo)下的DNA甲基化）途徑，PolIV和PolV（DNA依賴的RNA聚合酶）是植物所編碼特有的兩個聚合酶，也是RdDM所必需的［4］。在RdDM途徑中，由PolIV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的單鏈RNA，經(jīng)RDR2（RNA依賴的RNA聚合酶）基因編碼蛋白被合成雙鏈，之后，由DCL3基因編碼蛋白被加工為24 nt siRNA，并以單鏈形式被轉(zhuǎn)載到AGO4蛋白上，形成AGO-siRNA復(fù)合體。同時，由PolV在靶位點轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的非蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄本作為支架［5］。研究表明，KTF1基因編碼蛋白可以結(jié)合由PolV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的scaffolds，并招募AGO4蛋白形成AGO-siRNA復(fù)合體，并與IDN2蛋白和DDR復(fù)合體形成更大的RdDM效應(yīng)子蛋白復(fù)合體，之后，該效應(yīng)子蛋白復(fù)合體，通過一種未知的機制招募到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶到基因組特定位點，從而實現(xiàn)對靶位點的甲基化沉默［6］。

1 RD29Apro：LUC 篩選系統(tǒng)

RD29A是植物逆境脅迫應(yīng)答基因，啟動子區(qū)域含有ABA、干旱、鹽和冷脅迫應(yīng)答元件［7］。朱健康實驗室將RD29A啟動子與LUC基因連接，構(gòu)建成為RD29Apro：LUC表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)入到野生型擬南芥C24中，轉(zhuǎn)基因的擬南芥因此獲得2個甚至以上RD29A啟動子的拷貝數(shù)。經(jīng)過多代篩選后，獲得RD29A-LUC轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達的株系，對該株系進行EMS誘變處理后，在M2代中，經(jīng)過鹽處理后篩選異常發(fā)光的突變體［8］，經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)其中一個突變體，在經(jīng)過鹽脅迫處理后，失去發(fā)光能力。以此，將該突變體命名為ros1。通過圖位克隆，對該位點進行精細(xì)定位，并進行克隆測序，結(jié)果顯示，該ROS1基因編碼具有Ⅲ型核酸內(nèi)切酶功能域核蛋白，和參與DNA損傷修復(fù)的HhH-GPD超家族蛋白，具有顯著的相似性。關(guān)于其功能的描述有兩種假說：一種認(rèn)為ROS1蛋白可能參與阻止由smRNAs引發(fā)的DNA甲基化反應(yīng)；另一種學(xué)說則認(rèn)為ROS1蛋白直接作用DNA的去甲基化反應(yīng)，從而抑制特定DNA序列的過度甲基化水平［9］。該實驗結(jié)果得出的結(jié)論與后一種假說一致，在ros1突變體中，由于ROS1蛋白去甲基化功能的缺失，整個基因組甲基化水平處于較高的狀態(tài)，因此，轉(zhuǎn)基因被沉默，報告基因不會發(fā)出熒光。在此基礎(chǔ)上，以該ros1突變體為背景，實驗室又構(gòu)建出一種篩選系統(tǒng)，即RD29Apro：LUC/ros1篩選系統(tǒng)。

2 SDCpro：GFP篩選系統(tǒng)

研究表明，SDC（Suppressor of drm2cmt3）基因在擬南芥多個組織中的表達，受到DRM2和 CMT3的表達抑制，因此，SDC的表達沉默在drm2cmt3雙突變體中，而非各自單突變體中能夠得到釋放，SDC基因啟動子區(qū)域含有7個串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，可招募結(jié)合DNA甲基化蛋白，進而引起該基因的沉默。通過分子操作實驗，將SDC啟動子和綠色熒光蛋白GFP連接構(gòu)建融合表達篩選系統(tǒng)，將含有該SDCpro：GFP的融合載體，通過農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，由于SDC啟動子區(qū)域串聯(lián)重復(fù)序列的存在，轉(zhuǎn)基因擬南芥中GFP基因的表達因此被沉默，通過EMS突變處理后，從中篩選出GFP基因表達沉默被釋放的突變體。Steven E. Jacobsen實驗室通過該種方法，成功尋找到參與到甲基化沉默途徑的新基因AtMORC6［10］。研究表明，基因編碼蛋白含有一保守的腺苷三磷酸酶結(jié)構(gòu)域［11］，可能參與了染色質(zhì)超級結(jié)構(gòu)的重塑化過程，其作用機理可能是通過與RdDM途徑中的DMS3蛋白相互作用，參與到RdDM過程，實現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)控，也有的研究直接將AtMORC6/DMS11列為RdDM作用機制中的一個新成員基因。AtMORC6基因的發(fā)現(xiàn)證明，SDCpro：GFP篩選系統(tǒng)，可以成功的用于篩選參與甲基化調(diào)控途徑的新成員基因，且SDC作為RdDM途徑直接作用的靶位點［12］，受甲基化影響而沉默，使得該篩選系統(tǒng)更具有針對性。該系統(tǒng)的創(chuàng)新之處，就在于利用植物了內(nèi)源基因，啟動子區(qū)域特有的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，作為研究途徑的靶位點兩大優(yōu)勢，特異性地篩選新功能基因。

3 d35S：LUC-AP2篩選系統(tǒng)

LUC（LUCIFERASE）常作為報告基因被轉(zhuǎn)入作為水稻和煙草中，通過與底物反應(yīng)發(fā)出熒光，借此研究轉(zhuǎn)基因表達。陳雪梅實驗室將兩個35S啟動子串聯(lián)排列，分別啟動LUC和NPTⅡ（抗性篩選標(biāo)記）基因表達，構(gòu)建雙元35S啟動子融合熒光素酶表達系統(tǒng)構(gòu)建篩選系統(tǒng)，并與LUC基因末端融合一段AP2序列。該AP2序列包含miR172 結(jié)合位點，形成d35S：LUC-AP2和d35S：NPTⅡ結(jié)構(gòu)。該系統(tǒng)同時篩選分別參與RdDM和miRNAs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默途徑的新基因，為消除轉(zhuǎn)錄后基因沉默造成的影響，該表達系統(tǒng)通過農(nóng)桿菌被轉(zhuǎn)入到rdr6突變體中［13-14］，分離得到LUC信號中等強度水平的株系，將其命名為LUCH（LUC repressed by CHH methylation），通過EMS誘變處理后，從中篩選熒光信號高和低強度的突變體，并通過該系統(tǒng)篩選得到已知的參與DNA甲基化修飾的MOM1和ROS1等基因。除此之外，該系統(tǒng)同時篩選得到一新基因AMP1。該基因編碼產(chǎn)物為一膜整合蛋白，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和AGO1相關(guān)聯(lián)，AGO1是與膜相關(guān)的主要miRNAs效應(yīng)子蛋白［15］，表明該蛋白主要參與擬南芥miRNAs介導(dǎo)的翻譯抑制過程［14］，miRNAs主要通過作用于target mRNAs實現(xiàn)翻譯的抑制調(diào)控。但，該發(fā)生過程的亞細(xì)胞定位一直沒有被闡明，通過對AMP1亞細(xì)胞定位的鑒定和miRNAs作用的target mRNAs的分布研究，證實了miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制過程發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

目前，文獻已報道的篩選系統(tǒng)，遠(yuǎn)不止于以上3種，調(diào)控植物甲基化的方式也不止于RdDM、

DDM1等。從就目前已經(jīng)報道的篩選系統(tǒng)所得到的結(jié)果可看出，某些基因，如典型的RdDM途徑蛋白AGO4及不依賴于RdDM途徑的MOM1蛋白，在不同的篩選系統(tǒng)中，幾乎都可以被重復(fù)篩到，表明基因沉默的機理本身十分復(fù)雜，不同的沉默途徑之間并不是嚴(yán)格獨立的，相互之間可能存在著功能上的部分重疊，甚至是相互作用。隨著研究的深入，多數(shù)篩選系統(tǒng)對新基因的發(fā)掘趨于飽和，使新基因的發(fā)掘越來越有限。未來的研究，可能要通過構(gòu)建更加具有針對性的篩選系統(tǒng)，對介導(dǎo)甲基化沉默的不同通路之間的相互作用，進行深入探究，進一步揭示表觀遺傳學(xué)的分子機理。

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