硫氫化鈉致大鼠肺損傷現(xiàn)象的觀察及對(duì)活性氧的影響

張 帥 ， 李 蓓 ， 胡學(xué)遠(yuǎn) ， 范宏剛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030)

硫氫化鈉致大鼠肺損傷現(xiàn)象的觀察及對(duì)活性氧的影響

張 帥 ， 李 蓓 ， 胡學(xué)遠(yuǎn) ， 范宏剛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030)

為了研究常用劑量的硫氫化鈉(NaHS)致大鼠肺臟損傷程度以及與對(duì)活性氧(ROS)的影響，將96只SD大鼠隨機(jī)分為4組。各組大鼠分別腹腔注射生理鹽水、1 mg/kg體重NaHS、3 mg/kg體重NaHS、5 mg/kg體重NaHS后，于2、6、12 h和24 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分批處死，各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死6只大鼠。結(jié)果顯示，3個(gè)劑量的試驗(yàn)組肺臟中的ROS含量均有升高，其中3 mg/kg體重和5 mg/kg體重NaHS能夠引起嚴(yán)重的肺損傷，1 mg/kg體重NaHS對(duì)肺的影響較小。本試驗(yàn)表明NaHS所致的肺臟損傷與ROS的產(chǎn)生有關(guān)，NaHS干預(yù)肺臟相關(guān)的試驗(yàn)的安全劑量應(yīng)低于1 mg/kg體重。

硫氫化鈉 ； 肺 ； 活性氧

硫化氫(H2S)已成為繼NO和CO之后的第3類氣體信號(hào)分子，其在機(jī)體內(nèi)可以參與多種生理過(guò)程[1]。研究證實(shí)，H2S在抗氧化應(yīng)激[2]、清除自由基及抑制細(xì)胞凋亡等方面具有一定的功效[3]。硫氫化鈉(NaHS)作為一種外源性H2S的供體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究當(dāng)中。在機(jī)體內(nèi)，NaHS與H2S可以相互轉(zhuǎn)化，兩者以一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)存在。NaHS能夠解離為Na+和HS-，HS-又與H+結(jié)合產(chǎn)生H2S[4]。但究其本質(zhì)，H2S仍是一種有毒的氣體。在機(jī)體內(nèi)高濃度的H2S能夠抑制細(xì)胞色素氧化酶活性，通過(guò)與細(xì)胞色素C氧化酶中的Fe3+結(jié)合，阻礙其還原為含F(xiàn)e2+的還原型細(xì)胞色素C氧化酶，從而阻斷呼吸鏈的電子傳遞和分子氧的利用，提高線粒體中活性氧(ROS)助氧化劑的水平，進(jìn)而引起腦、肺、心、肝等重要臟器的代謝障礙及病理性損傷。因此，NaHS的毒性作用可能與ROS的產(chǎn)生水平有關(guān)。

肺臟因其特殊的肺泡結(jié)構(gòu)和氣體交換功能，使之易于受到ROS的氧化應(yīng)激的損傷[5-6]。然而，關(guān)于ROS在NaHS致大鼠肺臟中的毒性作用，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本文就試驗(yàn)常用劑量的NaHS致大鼠肺臟損傷程度以及與對(duì)ROS的影響進(jìn)行研究，以期為臨床及肺臟相關(guān)試驗(yàn)研究篩選一個(gè)相對(duì)安全的NaHS劑量范圍。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?選擇由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康SD大鼠96只，體重(225±25)g，試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由飲水和采食，保持良好的飼養(yǎng)環(huán)境。96只大鼠隨機(jī)分為4組，每組24只，并分別進(jìn)行以下處理：對(duì)照組(等體積的生理鹽水，腹腔注射)、NaHS I組(NaHS 1 mg/kg體重，腹腔注射)、NaHS II組(NaHS 3 mg/kg體重，腹腔注射)、NaHS III組(NaHS 5 mg/kg體重，腹腔注射)，各組大鼠分別于注射NaHS后2、6、12 h和24 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)頸椎脫臼分批處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死6只大鼠，冰上取肺臟組織備用。

1.2 試驗(yàn)方法 (1)用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的ROS試劑盒測(cè)定大鼠肺臟內(nèi)ROS濃度；(2)大鼠肺臟組織按常規(guī)切片及H.E.染色步驟處理；(3)取新鮮大鼠肺臟，表面吸干水分后稱重(濕重，W)，置于烤箱中烘烤至恒重(干重，D)，測(cè)定大鼠肺臟的干濕重比(W/D)：肺組織濕干重比(W/D)=濕重(W)/干重(D)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肺臟組織干濕重比(W/D)測(cè)定結(jié)果 從圖1中可以看出，同一時(shí)間點(diǎn)各組間比較，在2 h時(shí)，NaHS II組和NaHS III組的W/D值與對(duì)照組相比，差異極顯著(P<0.01)；在6 h時(shí)，NaHS II組的W/D值最低，明顯低于對(duì)照組和NaHS I組，且差異極顯著(P<0.01)；在12 h時(shí)，NaHS III組的W/D值最低，明顯低于其他三組，且差異極顯著(P<0.01)；在24 h時(shí)，NaHS II組和NaHS III組與對(duì)照組相比，W/D值較低，且差異極顯著(P<0.01)，而NaHS I組的W/D值基本與對(duì)照組相同，差異不顯著(P>0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 肺臟組織病理學(xué)變化結(jié)果 同一時(shí)間點(diǎn)各組間相比，對(duì)照組(見(jiàn)中插彩版圖2)大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰，肺泡間隔沒(méi)有腫脹現(xiàn)象；NaHS I組(見(jiàn)中插彩版圖3)大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)略有破壞，肺泡腔內(nèi)可觀察到少量滲出物，并有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔與對(duì)照組相比有一定的腫脹；NaHS II組(見(jiàn)中插彩版圖4)以及NaHS III組(見(jiàn)中插彩版圖5)大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞,肺泡間隔與對(duì)照組和NaHS I組相比明顯增厚，并且有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞滲出。并且，在NaHS II組和NaHS III組的大鼠肺臟組織中還可觀察到細(xì)支氣管的黏膜皺襞破損。相比之下，NaHS III組肺臟病變程度較NaHS II組的更加嚴(yán)重。2.3 ROS濃度測(cè)定結(jié)果 同一時(shí)間點(diǎn)各組間比較，在2 h時(shí)，NaHS I組的ROS含量與對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)，NaHS II組和NaHS III組的ROS含量與對(duì)照組相比，差異極顯著(P<0.01)；在6 h時(shí)，NaHS I組和NaHS III組的ROS含量與對(duì)照組相比，差異極顯著(P<0.01)，NaHS II組的ROS含量與對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)；在12 h，NaHS I組ROS含量最高，差異極顯著(P<0.01)，NaHS II組和對(duì)照組相比，差異不顯著(P>0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在24 h，NaHS III組的ROS含量明顯高于其他3組，差異極顯著(P<0.01)，NaHS I組ROS含量基本恢復(fù)到正常水平，與對(duì)照組差異(P>0.05)不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 肺臟組織活性氧(ROS)濃度變化

3 討論

從肺臟病理切片結(jié)果來(lái)看，NaHS II組和NaHS III組的病理變化明顯，這與肺臟干濕重比結(jié)果相符，說(shuō)明肺臟的病理變化與肺水腫有一定相關(guān)性。NaHS II組，在12時(shí)和24時(shí)，能看到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出，而且肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁腫脹，在3 mg/kg體重的注射劑量下，大鼠肺臟的W/D值與對(duì)照組相比存在顯著差異。NaHS III組的肺臟組織切片在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)出嚴(yán)重的病變，出現(xiàn)細(xì)支氣管黏膜皺襞破裂，肺泡壁腫脹甚至破裂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管腫脹等病理變化，說(shuō)明5 mg/kg體重的NaHS對(duì)大鼠的肺臟存在嚴(yán)重的損傷作用，而且NaHS III組的W/D值與對(duì)照組相比存在顯著差異，均低于對(duì)照組的W/D值，說(shuō)明NaHS以3 mg/kg體重和5 mg/kg體重的濃度注入機(jī)體后，不僅會(huì)引起肺水腫，還會(huì)引起肺炎的相關(guān)病理變化。張俊等通過(guò)肺臟干濕比和肺臟病理組織切片來(lái)進(jìn)行肺損傷的程度評(píng)定[7]，所以本試驗(yàn)組選用這兩個(gè)指標(biāo)來(lái)判定NaHS對(duì)肺臟是否造成損傷。綜合以上兩個(gè)試驗(yàn)，可以得出，不同濃度的NaHS會(huì)造成不同程度的肺損傷。

從ROS濃度的結(jié)果中可以看出， NaHS III組肺臟組織中的ROS含量基本都維持在一個(gè)較高水平，這與肺臟干濕比結(jié)果和肺臟病理切片結(jié)果基本保持一致，說(shuō)明在5 mg/kg體重的注射劑量下，NaHS III組能使ROS的含量升高。此外，研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)ROS升高與細(xì)胞色素氧化酶的活性受到抑制有關(guān)[8]。有學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞色素氧化酶活性能夠因?yàn)槿毖跫按x障礙而降低，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈中還原性中間體積聚在電子傳遞鏈中上游，從而引起整條電子傳遞鏈中缺失還原性中間體電子[9]，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS升高。而大量的ROS可引起細(xì)胞毒性作用，從而造成機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。所以，高劑量NaHS組的ROS水平高，可能是由于其造成呼吸鏈的損傷所導(dǎo)致[8]。而需氧量高的組織如心臟及含氧量高的組織如肺臟，對(duì)H2S影響氧化代謝的敏感性更高[10]。當(dāng)細(xì)胞色素氧化酶活性降低時(shí)，細(xì)胞活性氧(ROS)等助氧化劑生成增多，對(duì)于肺臟這種含氧量高的組織來(lái)說(shuō)，ROS可以導(dǎo)致非常嚴(yán)重的肺損傷。但是，NaHS II組和NaHS III組的ROS水平在2、6、12時(shí)呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，在24時(shí)卻呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，這可能是由于在2 h至12 h期間，H2S逐漸被機(jī)體所代謝，因此對(duì)細(xì)胞色素氧化酶的抑制作用逐漸減弱。但是隨著時(shí)間的推移，H2S對(duì)線粒體的損傷逐漸加重，所以使ROS的水平在24 h時(shí)呈現(xiàn)一個(gè)升高的趨勢(shì)。在NaHS I組，雖然能觀察到ROS水平有一定程度的升高，但是肺臟干濕比和病理切片結(jié)果都顯示肺臟組織沒(méi)有非常明顯的損傷。這可能是由于NaHS注入機(jī)體后，與細(xì)胞色素氧化酶中的Fe3+結(jié)合，有效的抑制線粒體呼吸，導(dǎo)致ROS水平升高。但所生成的ROS濃度較低并沒(méi)有造成嚴(yán)重的肺損傷，機(jī)體完全可以代償，肺臟組織沒(méi)有明顯病變。

綜合本試驗(yàn)所有結(jié)果可以得出，3 mg/kg體重NaHS和5 mg/kg體重NaHS腹腔注射能夠?qū)Υ笫蠓闻K產(chǎn)生明顯的損傷作用，并且肺臟損傷程度與ROS濃度存在一定的相關(guān)性，而1 mg/kg體重組對(duì)大鼠的肺臟沒(méi)有明顯的損傷作用。因此，本試驗(yàn)組認(rèn)為NaHS所致的肺臟損傷與ROS的產(chǎn)生有關(guān)。NaHS干預(yù)肺臟相關(guān)的試驗(yàn)的安全劑量應(yīng)低于1 mg/kg體重。

4 結(jié)論

3 mg/kg體重NaHS和5 mg/kg體重NaHS腹腔注射能夠引起明顯的肺臟損傷，并且肺損傷程度與ROS濃度存在一定的相關(guān)性，而1 mg/kg體重NaHS對(duì)大鼠肺臟沒(méi)有造成明顯損傷。因此，推薦NaHS干預(yù)肺臟相關(guān)的試驗(yàn)的安全劑量應(yīng)低于1 mg/kg體重。

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Observation of lung injury induced by sodium hydrogen sulfide in rats and its effect on the reactive oxygen species

ZHANG Shuai ， LI Bei ， HU Xue-yuan ， FAN Hong-gang

(College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the effect of sodium hydrogen (NaHS) on lung injury and reactive oxygen species (ROS)，96 SD rats were randomly divided into 4 groups.Rats in 4 groups were given intraperitoneal injection by normal saline，1mg/kg，3mg/kg，and 5mg/kg NaHS respectively.Rats in each group were sacrificed at 2 h，6 h，12 h and 24 h and 6 rats in each group were executed at each time point.The results showed that 1mg/kg，3mg/kg，and 5mg/kg NaHS increase the production of ROS in the lung.NaHS at 5mg/kg and 3mg/kg caused severe lung injury.However，1mg/kg NaHS had little effect on the lung.The study shows that lung injury caused by NaHS is related to the production of ROS，and the safe dose of NaHS in the lung should be less than 1mg/kg.

Sodium hydrogen sulfide; lung; Reactive Oxygen Species

FAN Hong-gang

2016-05-26

黑龍江省博士后科研啟動(dòng)金項(xiàng)目(LBH-Q14018)；東農(nóng)學(xué)者計(jì)劃“學(xué)術(shù)骨干”項(xiàng)目(15XG18)

張帥(1990-)，男，碩士生，從事動(dòng)物麻醉與鎮(zhèn)痛工作，E-mail:835365791@qq.com

范宏剛，E-mail：fanhonggang2002@163.com

S857.1

A

0529-6005(2016)12-0084-03