雙歧桿菌對(duì)雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及黏蛋白2含量的影響

張美曦， 隋 欣，2， 劉超男， 呂曉萍， 鄭世民， 高雪麗

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省雞西市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心， 黑龍江雞西158200)

雙歧桿菌對(duì)雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及黏蛋白2含量的影響

張美曦1， 隋 欣1，2， 劉超男1， 呂曉萍1， 鄭世民1， 高雪麗1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省雞西市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心， 黑龍江雞西158200)

本試驗(yàn)應(yīng)用過(guò)碘酸雪夫染色法、熒光定量PCR、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)飼喂雙歧桿菌后雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量、MUC2 mRNA表達(dá)量及腸液黏蛋白2(MUC2)含量變化進(jìn)行研究，揭示雙歧桿菌對(duì)雛雞局部黏膜免疫的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂雙歧桿菌后1～18 d雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量、MUC2 mRNA表達(dá)量及腸液MUC2含量不同程度高于對(duì)照雛雞。其中，回腸杯狀細(xì)胞數(shù)量、MUC2 mRNA及腸液MUC2含量于飼喂后1～4 d明顯高于對(duì)照雛雞(P<0.05或P<0.01)；結(jié)直腸MUC2 mRNA于飼喂后1～7 d極顯著高于對(duì)照雛雞(P<0.01)。結(jié)果表明，雙歧桿菌能增加雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量，提高M(jìn)UC2的分泌量，增強(qiáng)雛雞腸道黏膜免疫功能。

雙歧桿菌； 雛雞； 腸道； 杯狀細(xì)胞； 黏蛋白2

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是動(dòng)物腸道的優(yōu)勢(shì)菌群之一，經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)：該菌有提高機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗腫瘤、降膽固醇等作用，且憑借無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘留、無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已用作飼料添加劑服務(wù)于畜牧業(yè)。王雪飛[1]研究發(fā)現(xiàn)，苦豆籽粕-雙歧桿菌合生元可以提高肉仔雞免疫器官指數(shù)、血清IFN-γ含量及NK細(xì)胞活性，從而增強(qiáng)肉仔雞的免疫功能；邱春雷[2]等發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌活菌制劑治療潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著。黏蛋白2(Mucin 2)是腸道杯狀細(xì)胞分泌的一種黏蛋白[3]，是腸道黏液的主要成分，有潤(rùn)滑腸道、抵抗機(jī)械性破壞及防止腸內(nèi)有害物質(zhì)侵襲等作用，在腸道黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。目前，對(duì)雙歧桿菌的研究主要集中在腸道的分布及營(yíng)養(yǎng)作用，而對(duì)其能否通過(guò)增加腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及MUC2表達(dá)量，加強(qiáng)雛雞局部黏膜免疫功能沒(méi)有較系統(tǒng)的研究。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)飼喂雙歧桿菌后雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及MUC2含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，旨在探討雙歧桿菌提高雛雞腸道黏膜免疫的機(jī)制，為雙歧桿菌在禽業(yè)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡海藍(lán)白雛雞50只，雌雄各半，購(gòu)自哈爾濱某孵化場(chǎng)。經(jīng)雞馬立克病、雞傳染性腔上囊病、雞傳染性喉氣管炎和雞新城疫等抗體檢測(cè)，結(jié)果均呈陰性。

1.2 菌種 雙歧桿菌BB-12，購(gòu)自丹麥科漢森有限公司。

1.3 主要試劑 高碘酸，堿性品紅，偏重亞硫酸鈉，甲基綠，活性炭；Oligo(dT)15，北京天根生物科技有限公司；M-MLV Reverse Transcriptase，美國(guó)Promega公司；SYBR?Premix ExTaqT-MII，東洋紡(上海)生物科技有限公司；MUC2酶聯(lián)免疫分析試劑盒，上海瑞齊生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 將50只雛雞隨機(jī)分為對(duì)照組(簡(jiǎn)稱C組)、雙歧桿菌組(簡(jiǎn)稱B組)，其中，C組雛雞每日灌服一定劑量的空微膠囊，1次/d，連續(xù)灌服3 d；B組雛雞每日灌服一定劑量的雙歧桿菌微膠囊，1次/d，每次4×109CFU/mL，連續(xù)灌服3 d。兩組雛雞分別于灌服微膠囊3 d后第1、4、7、10、18天隨機(jī)抽取5只，心臟采血處死，快速采取回腸、盲腸、結(jié)直腸及相應(yīng)腸段的腸液，低溫保存，備檢。1.5 腸道杯狀細(xì)胞統(tǒng)計(jì) 對(duì)雛雞腸道組織進(jìn)行過(guò)碘酸雪夫染色(PAS染色)，觀察紅色深染的杯狀細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)6個(gè)腸絨毛上的杯狀細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)選取的絨毛大小應(yīng)基本一致。

1.6 腸組織MUC2 mRNA表達(dá)量測(cè)定 應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室已建立的雛雞MUC2 mRNA表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法[4]檢測(cè)腸組織MUC2 mRNA表達(dá)量。

1.7 腸液MUC2含量測(cè)定 按照MUC2酶聯(lián)免疫分析試劑盒提供方法檢測(cè)腸液MUC2含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出結(jié)論。

2 結(jié)果

2.1 腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量變化 應(yīng)用雙歧桿菌后1～18 d，雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量不同程度高于對(duì)照雛雞。回腸杯狀細(xì)胞數(shù)量于1～4 d顯著高于對(duì)照雛雞(P<0.05)；結(jié)直腸杯狀細(xì)胞數(shù)量于第1天顯著高于對(duì)照雛雞(P<0.05)；盲腸杯狀細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照雛雞，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖1,2(見中插彩版)。

圖1 應(yīng)用雙歧桿菌后雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量變化

*：有顯著性差異；**：有極顯著性差異；無(wú)*號(hào)：無(wú)顯著性差異，下表同

2.2 腸組織MUC2 mRNA表達(dá)變化 應(yīng)用雙歧桿菌后1～18 d，腸道MUC2 mRNA表達(dá)不同程度的高于對(duì)照雛雞。其中，回腸MUC2 mRNA于1～4 d顯著高于對(duì)照雛雞(P<0.01或P<0.05)；盲腸MUC2 mRNA于第1天顯著高于對(duì)照雛雞(P<0.05)；結(jié)直腸MUC2 mRNA于1～7 d極顯著高于對(duì)照雛雞(P<0.01)。如圖3。

2.3 腸液MUC2含量變化 應(yīng)用雙歧桿菌后1～18 d，雛雞腸液MUC2含量不同程度高于對(duì)照雛雞。其中，回腸腸液MUC2含量于1～4 d顯著高于對(duì)照雛雞(P<0.05或P<0.01)；結(jié)直腸腸液MUC2含量于第1天顯著高于對(duì)照雛雞(P<0.05)；盲腸腸液MUC2含量高于對(duì)照雛雞，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖4。

圖3 應(yīng)用雙歧桿菌后腸組織MUC 2 mRNA表達(dá)變化

圖4 應(yīng)用雙歧桿菌后雛雞腸液MUC 2含量變化

3 討論

動(dòng)物消化道黏膜面積較大，不僅是消化吸收的重要場(chǎng)所，也是體內(nèi)最大的外周免疫組織，是黏膜免疫系統(tǒng)重要組成部分。研究表明，禽類95%以上的感染發(fā)生在黏膜或由黏膜入侵，因此增強(qiáng)禽類局部黏膜免疫功能具有重要意義[5]。正常情況下，雙歧桿菌是腸道正常菌群中的優(yōu)勢(shì)菌群，可以通過(guò)占位作用、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)以及分泌代謝產(chǎn)物和細(xì)菌素抑制病原菌生長(zhǎng)，維持腸道菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[6]。腸上皮細(xì)胞、腸道內(nèi)的微生物群落及腸道黏液在腸道內(nèi)壁形成一層保護(hù)膜，在局部黏膜免疫中發(fā)揮重要作用，其中腸道黏液的主要成分是MUC2。

MUC2是腸道杯狀細(xì)胞分泌的一種分泌型黏蛋白。Juxing Chen[7]等發(fā)現(xiàn)，在腸屏障功能受損的肉雞體內(nèi)MUC2表達(dá)量降低；Chao[8]等研究表明，MUC2在黏液性結(jié)直腸癌的表達(dá)與局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。這些研究表明，MUC2不僅與腸道的屏障作用相關(guān)，與腫瘤發(fā)生也密切相關(guān)。本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)飼喂雙歧桿菌后雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及MUC2含量的變化，探討雙歧桿菌對(duì)雛雞腸道的營(yíng)養(yǎng)作用及其對(duì)MUC2分泌的影響。

3.1 雙歧桿菌對(duì)雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響 雙歧桿菌可合成多種消化酶和維生素，促進(jìn)氨基酸、脂類和維生素的代謝，促進(jìn)蛋白吸收；雙歧桿菌產(chǎn)酸可使環(huán)境pH值下降，有利于二價(jià)鐵、維生素D及鈣的吸收。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雛雞飼喂雙歧桿菌后1～18 d，腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量不同程度高于對(duì)照雛雞，回腸及結(jié)直腸杯狀細(xì)胞數(shù)量分別于1～4 d、第1天明顯高于對(duì)照雛雞(P<0.05)。證明雙歧桿菌可提高雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量。王文利[9]等研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以使肉雞小腸絨毛增長(zhǎng)，隱窩加深，黏膜增厚，通過(guò)改善小腸黏膜的結(jié)構(gòu)增強(qiáng)小腸的消化功能；劉克琳[10]等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用益生菌生態(tài)制劑后，鯉魚前腸黏膜褶皺增多，微絨毛長(zhǎng)而密，腸吸收面積增大，同時(shí)益生菌生態(tài)制劑也可促進(jìn)鯉魚生長(zhǎng)，增強(qiáng)免疫。以上試驗(yàn)結(jié)果均證明益生菌可以改善腸黏膜的結(jié)構(gòu)并使機(jī)體向有益的方向發(fā)展。本試驗(yàn)證實(shí)，雙歧桿菌可使雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量增加。

3.2 雙歧桿菌對(duì)雛雞腸道MUC2分泌量的影響 MUC2對(duì)腸黏膜有直接保護(hù)作用，當(dāng)其質(zhì)和量發(fā)生變化時(shí)，腸道屏障功能受損，通透性增高，腸腔內(nèi)抗原、內(nèi)毒素等促炎癥物質(zhì)進(jìn)入腸黏膜固有層，誘發(fā)免疫反應(yīng)[11]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雛雞應(yīng)用雙歧桿菌后1～18 d，腸道MUC2含量不同程度高于對(duì)照雛雞。其中，腸道MUC2 mRNA表達(dá)量于飼喂雙歧桿菌后1～4 d、1 d及1～7 d顯著高于對(duì)照雛雞(P<0.01或P<0.05)；回腸腸液MUC2含量于飼喂雙歧桿菌后1～4 d顯著高于對(duì)照雛雞(P<0.05或P<0.01)。以上結(jié)果表明，飼喂雙歧桿菌后，雛雞腸道MUC2分泌量增加，機(jī)體局部免疫功能增強(qiáng)。雙歧桿菌在雛雞腸道內(nèi)定植后，當(dāng)其增殖到一定數(shù)量時(shí)，可以通過(guò)激活巨噬細(xì)胞，活化自然殺傷細(xì)胞和提高免疫球蛋白(特別是IgA)的水平，增強(qiáng)機(jī)體非特異性和特異性免疫[12]。

腸道杯狀細(xì)胞分泌受多種因素影響，如腸道激素水平，腸道內(nèi)源及外源性物質(zhì)等。Stanley C M[13]在人大腸癌HT29-18N2細(xì)胞系檢測(cè)緩激肽對(duì)糖蛋白合成和黏液素分泌的調(diào)節(jié)，證實(shí)緩激肽可增加黏液素釋放；Kim S等[14]發(fā)現(xiàn)，杯狀細(xì)胞黏液素的分泌與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表達(dá)和活化有關(guān)；崔宏偉[15]等研究發(fā)現(xiàn)，飼喂乳酸桿菌可以增加雛雞腸道MUC2含量。以上研究均表明杯狀細(xì)胞分泌受多種因素的影響，益生菌能夠誘導(dǎo)MUC2的分泌以及上調(diào)基因表達(dá)，拮抗致病菌的腸道粘附、侵襲以及易位作用。

4 結(jié)論

雙歧桿菌通過(guò)增加雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量，上調(diào)腸道組織MUC2mRNA的表達(dá)量及腸液中MUC2含量，提高腸道黏膜免疫，增強(qiáng)機(jī)體抵抗致病菌的能力。

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Effects of Bifidobacterium to the number of goblet cells and the content of MUC2 in intestinal tract of chicks

ZHANG Mei-xi1， SUI Xin1,2， LIU Chao-nan1， LV Xiao-ping1， ZHENG Shi-min1， GAO Xue-li1

(1.College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China； 2.Center of Anima Disease Control and Prevention of Jixi City，Jixi 158200，China)

In order to study the effects of Bifidobacterium on local mucosal immune,periodic acid-schiff staining,quantitative real-time PCR and indirect enzyme-linked immunosorbent assay were used to study the number of goblet cells,expression of MUC2 mRNA of chicks’ intestinal tract and the content of MUC2 in intestinal mucus after administrated Bifidobacterium.The results were as follows：the number of goblet cells of chicks’ intestinal tarct,expression of MUC2 mRNA of chicks’ intestinal tract and the content of MUC2 in intestinal mucus in chicks administrated with Bifidobacterium were significantly enhanced when compared with those in the control group.Meantime,the number of goblet cells of ileum intestinal tract,the impression of MUC2mRNA of ileum intestinal tract and the content of MUC2 in ileum intestinal mucus were also significantly higher than those in the control group at 1-4 days after administrated Bifidobacterium (P<0.05orP<0.01); the impression of MUC2mRNA of colon intestinal tarct is extremely significantly higher than the control group in 1-7 days after administrated Bifidobacterium (P<0.01).The results showed that Bifidobacterium can enhance the number of goblet cells and affect the seretion of MUC2,each of which can enhance chicks’ intestinal mucosal immune function.

Bifidobacterium；chick；intestinal tarct；goblet cell；MUC2

GAO Xue-Li

2016-04-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31972162)

張美曦(1991-)，女，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物病理生理學(xué)，E-mail：zhangmercy@163.com

高雪麗，E-mail：gaoxueli@neau.edu.cn

S852.33

A

0529-6005(2016)12-0024-04