鳳仙花葉片提取物及萘醌類物質(zhì)抑菌活性研究

姜洪芳, 孫 鋼, 張 莉, 石寶俊, 束成杰, 張衛(wèi)明*

(1. 南京野生植物綜合利用研究院, 江蘇 南京210042; 2. 靖江市人民醫(yī)院, 江蘇 靖江 214500)

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鳳仙花葉片提取物及萘醌類物質(zhì)抑菌活性研究

姜洪芳1, 孫 鋼2, 張 莉2, 石寶俊1, 束成杰1, 張衛(wèi)明1*

(1. 南京野生植物綜合利用研究院, 江蘇 南京210042; 2. 靖江市人民醫(yī)院, 江蘇 靖江 214500)

采用濾紙片法測定鳳仙花葉片55%乙醇回流提取物及其所含的指甲花醌、2-甲氧基指甲花醌對大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌抑制活性。結(jié)果表明，鳳仙花葉片提取物在25.0 mg/mL時對受試的3種菌均有較好的抑制作用。指甲花醌濃度為1.56 mg/mL時，對白色念珠菌、綠膿桿菌的抑菌活性強于對大腸桿菌的抑制作用。2-甲氧基指甲花醌對白色念珠菌的抑菌活性強于對綠膿桿菌、大腸桿菌的抑制作用，對白色念珠菌的最低抑制濃度小于0.78 mg/mL。

鳳仙花葉片提取物；指甲花醌；2-甲氧基指甲花醌；抑菌活性

鳳仙花 (ImpatiensbalsaminaL.) 為鳳仙花科 (Balsaminaceae) 鳳仙花屬 (Impatiens) 一年生草本植物，其全草、花、根、果皮和種子均可入藥，其中花、莖、葉、種子在民間有悠久的藥用歷史，被廣泛用于各種中藥配方中，用于治療蛇咬傷、 鵝掌風(fēng)、 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 癰癤瘡疔等[1-2]，種子急性子為《中國藥典》(2010年版)收載品種?；瘜W(xué)成分主要有黃酮、萘醌、香豆素、有機(jī)酸、花青素和甾醇類[3]。據(jù)報道指甲花醌和2-甲氧基-1,4萘醌是該植物抗細(xì)菌和抗真菌的活性成分[4-6]，此外，2-甲氧基-1,4萘醌具有很強的對抗HepG2細(xì)胞的抗腫瘤活性。

現(xiàn)階段國內(nèi)外已對鳳仙花朵化學(xué)成分及其粗提物的抗細(xì)菌活性或者抗真菌活性進(jìn)行了研究。本實驗選取常見的細(xì)菌大腸桿菌、綠膿桿菌和常見真菌白色念珠菌，一方面研究鳳仙花葉片提取物抑菌活性，另一方面比較鳳仙花葉片萘醌類單體的抑菌活性，以確定起主要抑菌作用的化合物，為鳳仙花葉片這一資源的利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及菌種

鳳仙花葉片提取物：稱取已粉碎的鳳仙花葉片20 g，用55%乙醇回流提取3次 (每次3 h) ，合并提取液，60 ℃濃縮至無醇味。指甲花醌、2-甲氧基指甲花醌自制 (純度>90%)。乙醇、蒸餾水、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂等試劑均為分析純或生物制品。

大腸桿菌 (Escherichiacoli)，白色念珠菌(Candidaalbicans)，綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa) 以上菌種均由南京野生植物研究院提供。

1.2 儀器與試劑

抑菌實驗所需儀器與試劑：PH酸度計 (梅特勒公司)、電子天平 (梅特勒公司)、磁力攬拌器 (上?？粕齼x器有限公司)、生化培養(yǎng)箱 (上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、SW-CJ-ZFD超凈工作臺 (蘇凈集團(tuán)蘇州安泰技術(shù)有限公司)、立式壓力蒸汽滅菌器 (上海申安醫(yī)療器械廠)、THZ-072-HT小型搖床 (上海博彩生物科技有限公司)、KQ3200E超聲波清洗器 (昆山超聲波有限公司)、離心機(jī)、真空干燥器、打孔器 (2.5 mm)、鑷子。

1.3 培養(yǎng)基[7]

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水 l 000 mL, pH7.0～7.2，121 ℃滅菌 20 min。LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，瓊脂10.0 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.4 菌液的制備

采用比濁法制備各種菌懸液。菌種經(jīng)活化接種于試管斜面培養(yǎng)基培養(yǎng) (37 ℃，24～36 h) 用無菌水稀釋，菌液的孢子濃度控制在 107～108cfu/mL，備用。

1.5 抑菌活性測定

采用濾紙片稀釋法，供試菌為大腸桿菌，白色念珠菌，綠膿桿菌。鳳仙花葉片提取物用吐溫-80、丙二醇分別溶解成100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5mg/mL、6.25 mg/mL的溶液。指甲花醌溶解成12.50 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.56 mg/mL的溶液，2-甲氧基指甲花醌溶液的濃度分別為12.50mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.56 mg/mL，青霉素陽性對照12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.56 mg/mL。將菌種活化后，挑去菌落于150 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)10 h，每個培養(yǎng)皿分別加入20 μL菌液及10 mL培養(yǎng)基。搖勻，加入含有樣液的濾紙片，倒置，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小，重復(fù)3次，取其均值，同時制備空白對照培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

鳳仙花葉片提取物、指甲花醌、2-甲氧基指甲花醌在不同濃度下進(jìn)行大腸桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌抑菌活性測定。實驗結(jié)果見表1～3。可以看出，鳳仙花葉片萘醌單體化合物比提取物有較強的抑菌作用。當(dāng)鳳仙花葉片提取物濃度為25.00 mg/mL時，對實驗菌種綠膿桿菌、白色念珠菌的抑制作用較大腸桿菌強，其中對白色念珠菌的抑菌作用較強。指甲花醌、2-甲氧基指甲花醌對綠膿桿菌、白色念珠菌的最低抑菌濃度均為1.56 mg/mL，指甲花醌對大腸桿菌的最低抑菌濃度為3.125 mg/mL，而2-甲氧基指甲花醌在實驗濃度下對大腸桿菌無抑制作用。

表1 鳳仙花葉片提取物的抑菌作用 (抑菌圈直徑: mm)

注：“—”表示無抑菌作用。

由表1可以看出，鳳仙花葉片提取物對大腸桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌有抑菌活性作用。當(dāng)濃度為25.0 mg/mL時，除大腸桿菌外，對綠膿桿菌、白色念珠菌均有抑菌活性。當(dāng)濃度為50.00 mg/mL時，對上述2種細(xì)菌和真菌均有抑菌作用。

表2 指甲花醌的抑菌作用 (抑菌圈直徑: mm)

注：“—”表示無抑菌作用。

由表2可以看出，指甲花醌對白色念珠菌、綠膿桿菌的抑菌活性強于對大腸桿菌的抑制作用。當(dāng)濃度為1.56 mg/mL時，除大腸桿菌外，對綠膿桿菌、白色念珠菌均有抑菌活性。當(dāng)濃度為3.125 mg/mL時，對上述2種細(xì)菌和真菌均有抑菌作用。

由表3可以看出，在受試濃度下對大腸桿菌無抑制活性。2-甲氧基指甲花醌對白色念珠菌的抑菌活性強于對綠膿桿菌的抑制作用，當(dāng)濃度為1.56 mg/mL時，除大腸桿菌外，對綠膿桿菌、白色念珠菌均有抑菌活性。對白色念珠菌的最低抑制濃度應(yīng)當(dāng)?shù)陀?.78 mg/mL。

表3 2-甲氧基指甲花醌抑菌作用 (抑菌圈直徑: mm)

菌種名稱2-甲氧基指甲花醌最低抑菌濃度(MIC)/(mg/mL)12．56．253．1251．560．78青霉素對照品/(mg/mL)12．56．253．125大腸桿菌—————11．610．48．25綠膿桿菌11．9511．657．36．75—108．37．5白色念珠菌11．8510．910．159．18．35———

注：“—”表示無抑菌作用。

3 結(jié) 論

鳳仙花葉片提取物在25.0 mg/mL對常見細(xì)菌和真菌均有較好的抑制作用。單體實驗表明，指甲花醌濃度為1.56 mg/mL時，對白色念珠菌、綠膿桿菌的抑菌活性強于對大腸桿菌的抑制作用。2-甲氧基指甲花醌對白色念珠菌的抑菌活性強于對綠膿桿菌、大腸桿菌的抑制作用，對白色念珠菌的最低抑制濃度小于0.78 mg/mL。由此說明萘醌類物質(zhì)是鳳仙花葉片抑菌作用的主體，以往的實驗表明鳳仙花瓣有較強的抑菌作用，外用時可治療鵝掌風(fēng)、灰指甲、濕疹及癬瘡等。本次試驗表明鳳仙花葉片提取物也有較好的抑菌作用，增加了鳳仙花的用藥部位，確定葉片中含有的萘醌類物質(zhì)作為抑菌活性的主體，能抑制細(xì)菌和真菌的生長，尤其對綠膿桿菌、白色念珠菌有很強的抑制作用。而其對其他菌類的抑制活性及抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典：上冊 [ M ]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社, 1984 : 278-346.

[2] 王倩, 苗明三. 鳳仙花化學(xué)、藥理及臨床應(yīng)用分析[ J ]. 中醫(yī)學(xué)報, 2014, 29 (6) : 862-864.

[3] 胡喜蘭, 朱慧, 劉存瑞, 等. 鳳仙花的化學(xué)成分研究[ J ]. 中成藥, 2003, 25 (10) : 833-834.

[4] 秦海宏, 李德旺, 孫麗娟, 等. 鳳仙花水提物體外和體內(nèi)的抑菌活性[ J ]. 吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2013, 39 (1) : 60-64.

[5] 馬紅梅, 黎秋華, 岑紅煥. 鳳仙花葉不同提取物對細(xì)菌的抑制作用 [ J ]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報( 自然科學(xué)版) , 2012, 43 (2) : 193-196.

[6] 苗浩, 曹穎瑛, 商慶華, 等. 植物中萘醌類化合物及其衍生物的抗微生物作用的研究進(jìn)展[ J ]. 藥學(xué)實踐雜志 , 2012, 30 (5) : 334-336.

[7] 李明遠(yuǎn). 微生物學(xué)與免疫學(xué) [ M ]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2002 : 84-126.

Antimicrobial Activity of the Leave Extracts and Naphthoquinones from Impatiens balsamina L.

Jiang Hongfang1, Sun Gang2, Zhang Li2, Shi Baojun1,Shu Chengjie1, Zhang Weiming1 *

(1. Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042, China; 2. People's Hospital of Jingjiang, Jingjiang 214500, China)

The aim of this study was to investigate antimicrobial activities of 55% ethanol leave extraction, lawsone and 2- methoxy-1,4-naphthoquinone ofImpatiensbalsaminaL. to bacteria (such asEscherichiacoli,Pseudomonasaeruginosa) and fungi (such asCandidaalbicans). The results revealed that leave extraction at the concentration of 25.0 mg/mL can inhibit three kinds of bacteria, inhibition of bacterial is:C.albicans >P.aeruginosa>E.coli. Lawsone at the concentration of 1.56 mg/mL can better inhibitC.albicans andP.aeruginosathanE.coli. 2- Methoxy-1,4-naphthoquinone at the concentration of 0.78 mg/mL can better inhibitC.albicans thanP.aeruginosaandE.coli.

ImpatiensbalsaminaL. leave extracts; lawsone; 2- methoxy-1,4-naphthoquinone; antibacterial activity

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.06.006

2016-05-12

國家“十二五”科技支撐計劃(2012BAD36B01)。

姜洪芳，副研究員，主要研究天然產(chǎn)物活性物質(zhì)應(yīng)用與開發(fā),E-mail:jhf74@163.com

*通訊作者： 張衛(wèi)明。 E-mail: botanyzh@163.com

Q946

A

1006-9690(2016)06-0024-03