狨猴腹瀉重要病原菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)研究

張占恒，高珂珂，李小慧，林 靜，洪瑩瑩，金天明，韓文瑜

（1. 吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062；2. 天津醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，天津300070；3. 天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

狨猴腹瀉重要病原菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)研究

張占恒1,2，高珂珂3，李小慧3，林 靜3，洪瑩瑩3，金天明3，韓文瑜1,通信作者

（1. 吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062；2. 天津醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，天津300070；3. 天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

狨猴腹瀉病是一種常見(jiàn)疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、消瘦、精神不振等。對(duì)臨床發(fā)現(xiàn)的天津市某動(dòng)物中心腹瀉狨猴，采集糞便進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、顯微鏡鏡檢、生化試驗(yàn)并進(jìn)行16S rRNA片段擴(kuò)增等，鑒定出導(dǎo)致該猴群腹瀉的病原菌主要是大腸桿菌和沙門菌。藥敏試驗(yàn)顯示大腸桿菌對(duì)慶大霉素高度敏感，沙門菌對(duì)慶大霉素和氨芐西林高度敏感，為該病的治療提供了依據(jù)。

狨猴；腹瀉；病原菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

狨猴是一種珍貴的小型靈長(zhǎng)類動(dòng)物，主要分布于南美洲地區(qū)。狨猴由于體型小，繁殖率高，與人類的疾病應(yīng)急生理反應(yīng)很相似，特別是在實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中用藥量小，因此被廣泛用于動(dòng)物學(xué)，生殖學(xué)，藥理學(xué)等研究[1-2]。腹瀉病作為一種常見(jiàn)疾病，可造成狨猴消瘦，營(yíng)養(yǎng)不良，繁殖率下降甚至死亡。

本試驗(yàn)采集天津市某動(dòng)物中心腹瀉狨猴的糞便，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、顯微鏡鏡檢、生化試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室診斷，分離出導(dǎo)致腹瀉的重要病原菌—大腸桿菌、沙門菌。對(duì)病原菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，大腸桿菌對(duì)氯霉素高度敏感，沙門菌對(duì)慶大霉素和氨芐西林高度敏感。本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)該動(dòng)物中心腹瀉狨猴的合理用藥提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)預(yù)防和治療狨猴腹瀉病具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源

采集患病狨猴肛門附近的新鮮糞便，裝入無(wú)菌離心管中，4 ℃運(yùn)輸，2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃保存，備用。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

革蘭氏染液，購(gòu)自南京建成科技有限公司；微量生化管，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；XLD培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等均按常規(guī)方法制備；基本生化試劑等均由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已發(fā)表的細(xì)菌16S rRNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物[3]，引物名稱與序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物名稱及序列

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化

無(wú)菌采取患病狨猴糞便，取適量生理鹽水稀釋10倍，再依次倍比稀釋至10-9，每個(gè)梯度分別接種于LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)16～20 h后，挑取單個(gè)菌落分別接種于麥康凱和XLD培養(yǎng)基，培養(yǎng)并觀察菌落形態(tài)，再挑取單個(gè)菌落進(jìn)行分離培養(yǎng)。觀察并記錄病原菌菌落的生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 病原菌擴(kuò)大培養(yǎng)

分別挑取單個(gè)菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)16～18 h，4 ℃保存，備用。

1.2.3 顯微鏡觀察

用移液槍無(wú)菌移取20 μL搖勻的菌液，置于干凈的載玻片上并攤勻，自然晾干后，進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察記錄病原菌的菌體形態(tài)特征。

1.2.4 生化試驗(yàn)

選取葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇等生化管，打開(kāi)生化管后，用接種環(huán)每管分別加入分離出的病原菌，倒置生化管于37 ℃ 5％的CO2恒溫培養(yǎng)箱36 h，觀察記錄每個(gè)生化管中的現(xiàn)象。

1.2.5 病原菌16S rRNA基因的擴(kuò)增與測(cè)序

以菌液為模板，XJTY-F和XJTY-R為上下游引物，對(duì)病原菌16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系：2×Taq酶預(yù)混液10 μL，滅菌去離子水 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，于自動(dòng)凝膠成像儀上觀測(cè)結(jié)果。剩余PCR產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物由上海生工生物股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析。

1.2.6 藥敏試驗(yàn)

取生理鹽水，調(diào)液體培養(yǎng)的菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，含菌量?×108～2×108CFU/mL。取滅菌的棉簽拭子浸入純化好的菌懸液中，將多余的菌液在管壁擠出，涂布在培養(yǎng)基上，旋轉(zhuǎn)平皿60°，重復(fù)涂3次。室溫靜置3～5 min，無(wú)菌條件下將藥敏片放在固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上均勻放置6個(gè)藥敏片，于37 ℃ 5％的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，測(cè)量抑菌圈的直徑，并根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]判定該細(xì)菌對(duì)各抗生素藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

患病狨猴腹瀉，糞便呈黃色黏液狀、脫毛、精神沉郁、反應(yīng)遲鈍、食欲下降、機(jī)體消瘦，個(gè)別呈現(xiàn)嘔吐、發(fā)熱等癥狀。

2.2 菌落特征和形態(tài)

分離出的病原菌Ⅰ在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)光滑、圓形、桃紅色的菌落（圖1），油鏡下可見(jiàn)細(xì)菌呈兩端鈍圓的短小桿狀，不呈長(zhǎng)鏈狀排列，無(wú)芽孢，革蘭氏陰性菌（圖2），在LB上菌落黃色（圖3），有白色絮狀沉淀。

圖1 病原菌Ⅰ在麥康凱培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖2 油鏡下病原菌Ⅰ的革蘭染色形態(tài)

圖3 病原菌Ⅰ在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

病原菌Ⅱ使XLD培養(yǎng)基變紅，菌落中央黑心（圖4），油鏡下可見(jiàn)細(xì)菌呈兩端鈍圓的桿狀，革蘭氏陰性菌（圖5）。

圖4 病原菌Ⅱ在XLD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖5 在油鏡下病原菌Ⅱ的革蘭染色形態(tài)

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

將分離出的病原菌Ⅰ接種到生化管，37 ℃培養(yǎng)36 h，均可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、靛基質(zhì)，不發(fā)酵硫化氫、尿素（表1-1），其他生化特性與大腸桿菌的特征相符合，初步確定為大腸桿菌。

將分離出的病原菌Ⅱ接種到生化管，37 ℃培養(yǎng)36 h，均可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、賴氨酸、硫化氫，不發(fā)酵乳糖、蔗糖、鳥(niǎo)氨酸、靛基質(zhì)、尿素（表1-2），其他生化特性與沙門菌的特征相符合，初步確認(rèn)為沙門菌。

表1-1 病原菌Ⅰ的生化試驗(yàn)結(jié)果

表1-2 病原菌Ⅱ的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 分離菌株16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

以提取的分離菌株基因組為模板，XJTY-F、XJTY-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出約1 500 bp的特異性片段（圖6）。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的大腸桿菌基因序列和沙門菌序列進(jìn)行比對(duì)，同源性高達(dá)99.0％和99.5％。證明分離菌分別為大腸桿菌和沙門菌。

圖6 分離菌株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果（注：1～5：分離菌16S rRNA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；M：DM 2000）

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株大腸桿菌對(duì)慶大霉素高度敏感，對(duì)環(huán)丙沙星和大觀霉素中度敏感；對(duì)卡那霉素、四環(huán)素和紅霉素不敏感；對(duì)氨芐霉素、氧氟沙星、氟哌酸和新霉素耐藥（如表2-1）。分離株沙門菌對(duì)慶大霉素和氨芐西林高度敏感；對(duì)卡那霉素、大觀霉素和環(huán)丙沙星中度敏感；對(duì)鏈霉素、四環(huán)素、氧氟沙星和紅霉素不敏感；對(duì)氟哌酸和新霉素耐藥（表2-2）。

表2-1 大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2-2 沙門菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

狨猴作為一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其健康狀況關(guān)系到試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，而腹瀉病是狨猴的常見(jiàn)疾病，發(fā)病后應(yīng)引起高度重視，及時(shí)找出傳染源和致病原因，并加強(qiáng)治療。感染細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)以及應(yīng)激、環(huán)境因素的改變都可能引起狨猴的腹瀉，細(xì)菌感染是其中常見(jiàn)的病因之一，既可能是感染單一細(xì)菌，也有可能是多種細(xì)菌混合感染。目前，沙門菌和大腸桿菌感染猴導(dǎo)致腹瀉比較普遍[5]，志賀氏菌感染也常見(jiàn)報(bào)道[6]。本試驗(yàn)采集天津市某動(dòng)物中心腹瀉狨猴的糞便，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、顯微鏡鏡檢、生化試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室診斷，分離出導(dǎo)致猴群本次腹瀉的病原菌主要是大腸桿菌和沙門菌。

本試驗(yàn)應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)細(xì)菌，具有準(zhǔn)確和特異的優(yōu)點(diǎn)。生物細(xì)胞DNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)中既具有保守的片段，又具有變化的堿基序列，保守的片段反映了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變片段則能表明物種間的差異，那些保守的或高變的特征性核苷酸序列則是不同分類級(jí)別生物（如科、屬、種）鑒定的分子基礎(chǔ)[7]，所以可根據(jù)rDNA（核糖體DNA）序列設(shè)計(jì)用于某一種、屬、科甚至更大類群范圍的微生物檢測(cè)或鑒定的探針。目前，以16S rRNA為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增靶分子的細(xì)菌快速分類鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法已經(jīng)成功建立[8-9]，該方法可以應(yīng)用于細(xì)菌種、屬和科的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析等。

在本試驗(yàn)檢測(cè)的11種常用藥物中，不同的分離菌株對(duì)不同的抗生素產(chǎn)生耐藥性。這種現(xiàn)象可能是發(fā)生細(xì)菌病時(shí)未開(kāi)展細(xì)菌藥敏試驗(yàn)，盲目亂用抗生素導(dǎo)致的。致病菌的耐藥性增強(qiáng)的情況復(fù)雜，臨床用藥存在很大困難。致病性大腸桿菌的耐藥性現(xiàn)象已普遍存在，而且多為多重耐藥[10]，沙門菌和大腸桿菌類似，所以在抗菌藥物的選擇上要考慮準(zhǔn)確的劑量和療程，采取適當(dāng)?shù)穆?lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥的方式。一方面可以充分發(fā)揮抗菌藥物之間的協(xié)同作用，增加療效；另一方面可以避免病原菌長(zhǎng)期與某一種藥物接觸，增加產(chǎn)生耐藥性機(jī)率。同時(shí)合理應(yīng)用維生素、益生素等輔助藥物，恢復(fù)機(jī)體的生理機(jī)能，增強(qiáng)自身免疫能力，真正做到合理用藥和科學(xué)用藥，最大限度的降低耐藥性的產(chǎn)生。

本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)該動(dòng)物中心腹瀉狨猴的合理用藥提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)預(yù)防和治療狨猴腹瀉病具有一定的指導(dǎo)意義。

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Study on Isolation and Identification of Marmoset Diarrhoea Pathogenic Bacteria Strain and Its Sensitivity Tests to Drug

ZHANG Zhan-heng1,2,GAO Ke-ke3, LI Xiao-hui3, LIN Jing3, HONG Ying-ying3, JIN Tian-ming3, HAN Wen-yu1,Corresponding Author
（1. College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China; 2. Department of Laboratory Animal, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 3. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China.）

Diarrhoea is a kind of marmoset disease which mainly caused diarrhea, weight loss and spirit depressed. In this paper, the stool samples were collected from marmoset in an animal center in Tianjin. Then the samples were used for a series of laboratory diagnosis, such as bacterial isolation and culture, microscopic examination, biochemical tests and PCR detection of 16s rRNA to identified the isolated strains. The results showed that the isolated strains wereEscherichia coliandSalmonella. Drug sensitive test was examined, and the results showed that the isolatedEscherichia colistrain is highly sensitive to gentamicin, the isolatedSalmonellastrain is highly sensitive to gentamicin and ampicillin.

marmoset; diarrhoea; isolation and identification; drugs sensitive test

S852.61

A

1008-5394（2016）04-0005-04

2016-08-10

天津市優(yōu)秀科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目“獸醫(yī)生物技術(shù)”（TD12-5019）；天津市優(yōu)秀科技特派員項(xiàng)目“規(guī)模化豬場(chǎng)腹瀉病的監(jiān)測(cè)及凈化技術(shù)研究”（16JCTPJC45000）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目“規(guī)?；i場(chǎng)仔豬腹瀉病的監(jiān)測(cè)及防控技術(shù)推廣”（201601380）

張占恒（1988-），男，天津市人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事病原微生物檢測(cè)與耐藥性的研究。E-mail：zhangzhanheng@tmu.edu.cn。

韓文瑜（1955-），男，河北阜城人，教授，博士，主要從事病原微生物檢測(cè)與耐藥性的研究。E-mail：hanwy@jlu.edu.cn。