HIV暴露嬰兒早期診斷實驗室檢測策略及意義

范文成，姚 均

·專題綜述·

HIV暴露嬰兒早期診斷實驗室檢測策略及意義

范文成，姚 均

對于HIV陽性孕婦所生的嬰兒，由于被動接受了來自母親的HIV抗體，出生后18個月內(nèi)不能通過血清學(xué)檢測進行HIV感染的診斷，因此HIV暴露嬰兒早期診斷實驗室檢測策略不同于成人。目前暴露嬰兒早期診斷實驗室檢測策略在國際上并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但各國之間的檢測策略大體一致，略有差異。近年來研究發(fā)現(xiàn)，盡早進行抗病毒治療可以顯著改善HIV感染嬰兒結(jié)局，延長其生命。因此，早期診斷變得極為重要。本文就現(xiàn)行的HIV暴露嬰兒早期診斷實驗室檢測策略進行綜述，為盡早診斷HIV暴露嬰兒感染狀態(tài)，開展早期抗病毒治療，消除兒童艾滋病提供支持。

母體胎兒間交換；HIV-1；早期診斷

HIV感染是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題，同樣也嚴(yán)重威脅著婦女和兒童的健康與生命。如果HIV陽性孕婦未進行任何母嬰阻斷措施，HIV母嬰傳播率將高達30.0％～40.0％，目前我國母嬰傳播率控制在7.1％（全國平均），原因是仍有部分HIV感染的孕婦由于未及時接受孕產(chǎn)期保健服務(wù)和檢測而未能被及時發(fā)現(xiàn)，得不到有效的母嬰阻斷干預(yù)，使得母嬰傳播率較高[1]。新生嬰兒感染HIV后，其生命將受到嚴(yán)重威脅。有研究表明，小于2歲的HIV感染兒童，大約有50％病情迅速惡化并很快死亡[2-3]。HIV暴露嬰兒早期檢測，能夠盡早對新生嬰兒的HIV感染狀態(tài)作出診斷，及時告知家庭，陰性檢測結(jié)果有利于減輕家長心理負擔(dān)，陽性檢測結(jié)果的患兒可得到及時抗病毒治療，這對保障感染兒童生命質(zhì)量具有實質(zhì)性益處[4]。2013年6月，聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署再次強調(diào)了“2015年消除兒童HIV感染”的全球目標(biāo)，并提出實現(xiàn)該目標(biāo)的12點建議，其中包括嬰幼兒早期診斷檢測及早治療策略等未來研究方向[5-6]。因此，HIV感染新生兒及時診斷成為亟待解決的重要研究課題之一，本文即是針對目前現(xiàn)有的HIV嬰兒早期檢測策略研究進展作一綜述。

1 現(xiàn)行的HIV暴露嬰兒早期診斷實驗室檢測策略

1.1 WHO推薦策略 WHO在2013年《兒童抗病毒治療指南》[7]中建議HIV陽性孕婦所生小于18月齡的HIV暴露的嬰幼兒，按如下檢測流程進行：①有病毒學(xué)檢測條件的地區(qū)應(yīng)在嬰兒出生后4～6周進行病毒學(xué)檢測，若檢測呈陽性反應(yīng)，則認為嬰兒或兒童可能感染HIV，應(yīng)立即進行抗病毒治療，同時盡快采集第2份樣品進行病毒學(xué)復(fù)檢，如仍為陽性即可診斷感染。②當(dāng)檢測結(jié)果為陰性，若從未進行母乳喂養(yǎng)，則認為未感染HIV，若正在或曾經(jīng)進行過母乳喂養(yǎng)，則在完全停止母乳喂養(yǎng)前仍有感染HIV的風(fēng)險。③若條件限制，本實驗室或本地區(qū)不能進行病毒學(xué)檢測，則進行定期隨訪，如果隨訪過程中嬰兒出現(xiàn)癥狀，應(yīng)立即采樣并將樣品送到有病毒學(xué)檢測能力的實驗室進行檢測，若檢測結(jié)果為陽性，則認為嬰兒或兒童可能感染HIV，應(yīng)進行抗病毒治療，同時盡快采集第二份樣品進行病毒學(xué)復(fù)檢，如仍為陽性即可診斷感染。若檢測呈陰性反應(yīng)，則在18月齡時和/或在停止母乳喂養(yǎng)6周后進行抗體檢測。④若仍沒有相關(guān)實驗室能為其進行病毒學(xué)檢測，則在嬰兒9月齡時進行HIV抗體檢測，抗體檢測結(jié)果陽性并且又有相關(guān)癥狀，則嬰兒或兒童可能被感染。若檢測結(jié)果為陰性，則認為未感染。見圖1。

圖1 WHO嬰幼兒早期診斷檢測策略Figure 1 WHO early diagnosis and detection strategy for infants

1.2 美國實驗室檢測策略 對于出生后不滿18月齡的嬰兒，病毒學(xué)檢測時間點依次為出生時（可選）2～3周齡、1～2月齡和4～6月齡。若檢測結(jié)果為陽性，盡快采集第二份樣本進行重復(fù)試驗；若檢測結(jié)果為陰性，則在下一個推薦的時間節(jié)點進行重復(fù)檢測。只有連續(xù)2次獨立的樣本檢測呈陽性結(jié)果可以確證嬰兒HIV感染，排除HIV感染同樣需要至少2個陰性結(jié)果，在嬰兒1月齡后和4月齡后分別采集的兩份樣本最佳。指南中還對幾種特殊情況進行了單獨說明，包括后期血清轉(zhuǎn)化，產(chǎn)后感染和HIV-2感染等。在2015年3月更新的美國抗病毒指南中，最遲的血清轉(zhuǎn)化時間推遲到了24月齡，這對完善現(xiàn)行的各國嬰幼兒早期診斷檢測策略有著重要意義[8]。

1.3 中國實驗室檢測策略 《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》[9]中建議于嬰兒出生后6周采集第一份血樣本送檢進行病毒學(xué)檢測。若第一份血樣本檢測呈陽性反應(yīng)，盡快采集第二份血樣本進行病毒學(xué)檢測。若2份病毒學(xué)血樣本檢測均呈陽性反應(yīng)，診斷兒童HIV感染。若第二份病毒學(xué)檢測呈陰性反應(yīng)，待嬰兒滿3月齡再次采集血樣本進行檢測。若第一份血樣本檢測呈陰性反應(yīng)，隨訪并待嬰兒滿3月齡再次采集血樣本進行檢測。

若嬰兒3月齡核酸檢測再次呈陰性反應(yīng)，按照未感染兒童處理；于兒童12月齡時，開始HIV抗體檢測，最終確定兒童感染狀態(tài)。若嬰兒3月齡核酸檢測呈陽性反應(yīng)，盡快再次采集血樣本進行檢測。若第三份血樣本核酸檢測呈陽性反應(yīng)，診斷兒童感染；若第三份血樣本檢測呈陰性反應(yīng)，嬰兒未感染。

不同時間病毒學(xué)檢測均呈陰性反應(yīng)的喂哺母乳的兒童，應(yīng)在完全停止喂哺母乳后的6周和3月齡（若6周時檢測結(jié)果為陽性可盡快）再次采血進行核酸定性檢測，兒童滿18月齡后則可直接進行抗體檢測。

如果嬰兒第一次采血時已滿3月齡，但未滿12月齡，則應(yīng)盡快在不同時間采集2份血樣本；同時將2份血樣本送檢，按照前述流程進行檢測。如果兒童第一次采血時已滿12月齡，則應(yīng)首先進行HIV抗體檢測[9]。見圖2。

圖2 中國嬰幼兒早期診斷檢測策略Figure2 Chinese early diagnosis and detection strategy for infants

從以上各檢測策略可以看出，當(dāng)前各國現(xiàn)行的嬰兒HIV感染早期診斷實驗室檢測在國際上雖沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但在檢測時間、判定標(biāo)準(zhǔn)及排除方法等方面大致相同[10-11]：①小于18月齡為HIV陽性產(chǎn)婦所生的嬰兒首選病毒學(xué)檢測診斷是否感染HIV，且首次采樣檢測時間是4～6周齡，并強調(diào)2次病毒學(xué)檢測結(jié)果陽性才能確定HIV感染；②在沒有條件開展病毒學(xué)檢測的地區(qū)，建議在嬰兒9月齡后開始進行抗體檢測。抗體檢測具有特異性高、操作簡單及花費低的特點。因為母親透過胎盤屏障傳給嬰兒的IgG抗體大多于9個月后從未感染嬰兒體內(nèi)消失，因此，檢測結(jié)果陰性可以用于嬰兒排除HIV感染；③對于檢測前有過母乳喂養(yǎng)史的嬰兒，須在徹底停止母乳喂養(yǎng)6周后再次進行檢測確認檢測結(jié)果；④所有嬰兒在18月齡時母源性抗體消退后須進行抗體確證試驗，但最新的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)18月齡時個別嬰幼兒體內(nèi)的母源性抗體仍然存在。因此，美國最新抗病毒指南建議在24月齡時進行抗HIV抗體的確證試驗[12]。

2 目前推薦的嬰兒HIV感染早期診斷試驗方法

2.1 核酸檢測方法 核酸檢測又可分為核酸定性檢測與定量檢測，定性檢測又有商品化的試劑盒和實驗室自建方法。目前在用的商品化試劑盒主要有以下幾種。

2.1.1 羅氏公司的實時熒光PCR （real-time PCR）擴增試劑 包括用于定量的COBAS AmpliPrep /TaqMan HIV-1test和Amplicor HIV-1 Monitor，可使用血漿、血清或干血斑樣本。擴增靶核酸位置是gag基因區(qū)，可擴增HIV-1 M組的A-H基因亞型。定量測定含量為50～750 000 copies/ml HIV-1 RNA。標(biāo)準(zhǔn)法的檢測線性范圍是400～750 000 copies/ml；超敏法的線性范圍是50～100 000 copies/ml。定性試劑盒為AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test v2.0，該試劑盒可同時擴增和檢測HIV-1基因組中不受藥物選擇壓力限制的2個不同區(qū)域。這種獨特、雙靶標(biāo)設(shè)計，能夠提供更可靠的檢測結(jié)果，更準(zhǔn)確診斷HIV感染。

2.1.2 雅培公司的M2000系統(tǒng) 可檢測血漿、血清、全血或干血斑等多種樣本。擴增靶核酸位置是pol基因區(qū)，擴增HIV-1基因亞型是M組的A-G亞型和O組以及N組病毒。定量檢測試劑盒是Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent，定量檢測線性范圍是40～1 000 000 copies/ml。定性檢測試劑盒是Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent Qualitative AMP Kit[13-14]。

2.1.3 生物梅里埃公司的NucliSensEasyQ HIV-1 Assay 9即核酸序列擴增技術(shù) 該技術(shù)也是目前國內(nèi)常用的HIV RNA定量檢測方法，主要用于HIV感染后病程進展檢測和治療效果監(jiān)控評價，也可以作為檢測嬰幼兒HIV感染狀態(tài)的間接手段。NuclisensEasyQ法使用血漿和干血斑樣本進行RNA模板制備與核酸擴增。擴增靶核酸位置是gag基因區(qū)，擴增HIV-1基因亞型是M組的A-G亞型。檢測線性范圍是50～3 000 000 copies/ml[9]。

2.1.4 實驗室自建方法 由各實驗室自己設(shè)計引物，建立最優(yōu)擴增體系，根據(jù)目的基因片段擴增有無來判斷結(jié)果。中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病中心參比室建立了3區(qū)聯(lián)合巢式PCR（N3M-PCR, nested three-monoplexhiv -1 DNA PCR）。該方法使用3套引物對HIV-1的env、gag和pol基因區(qū)進行擴增，綜合3區(qū)的擴增結(jié)果對新生兒的感染狀況作出定性判斷以達到嬰幼兒HIV感染早期診斷的目的[15-16]。

此外，美國食品藥品監(jiān)督管理局也批準(zhǔn)了Gen-Probe Aptima Qualitative HIV-1 RNA Assay方法進行嬰幼兒早期診斷檢測[17]。

總之，核酸定性檢測結(jié)果可用于嬰兒HIV感染早期診斷，核酸定量檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)與臨床資料作為嬰幼兒早期診斷的輔助方法[7]。

2.2 血清學(xué)檢測方法 HIV陽性孕婦只有IgG抗體可以通過胎盤屏障進入胎兒體內(nèi)，IgA、IgM、IgE 3種抗體是不能透過胎盤屏障的。因此，從原理上講，在嬰兒體內(nèi)檢測到3種抗體可以提示嬰兒感染，但相關(guān)的研究證明，即使HIV感染嬰兒，由于其免疫系統(tǒng)發(fā)展不完善，這3種抗體含量極低，用于診斷敏感性太低而難于實際應(yīng)用[18]。同時有研究表明：宮內(nèi)感染的嬰兒被動獲得的母親的HIV IgG抗體，12～18個月之后才能全部消退，若在18個月內(nèi)進行HIV抗體檢測用于診斷感染，可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果[19]。因此WHO及許多國家推薦將血清學(xué)檢測用于18月齡內(nèi)嬰兒排除HIV感染的手段。

2.3 流式細胞儀測定 國內(nèi)外均有學(xué)者對使用CD4/CD8比值進行嬰幼兒早期診斷進行研究，檢測結(jié)果與實際結(jié)果一致性良好。該指標(biāo)結(jié)合臨床可以作為嬰幼兒早期診斷的參考方法[20-21]。

綜上所述，WHO建議HIV嬰兒感染早期實驗室診斷策略應(yīng)該達到95％以上的靈敏度和98％以上的特異度[22]。目前各國現(xiàn)行檢測策略雖然能夠保證高靈敏度與高特異度，但這是通過相對延遲檢測時間達到的。近年來的研究表明，如果HIV感染嬰兒出生后6～12周內(nèi)開始抗病毒治療，可以使嬰兒病死率降低76％，疾病進展減緩75％[23]。

在著名的“密西西比嬰兒”案例中，研究人員在嬰兒出生30 h后即使用外周血單核細胞進行HIV DNA PCR方法定性檢測，檢測結(jié)果陽性，隨后在嬰兒出生31 h后進行病毒載量檢測，檢測結(jié)果為19 812 copies/ml。臨床醫(yī)生立即用3種抗病毒藥物——齊多夫定、拉米夫定和奈韋拉平進行雞尾酒療法。18月齡時治療意外中斷了5個月時間，再次就醫(yī)時其HIV載量檢測結(jié)果仍然小于最低檢測線[24]。表明在停藥后，仍成功抑制病毒。雖然2014年7月，曾被認為“治愈”的這名艾滋病女童在停藥約2年后體內(nèi)再次檢測出HIV。但“密西西比嬰兒”依然向科學(xué)家提供了有關(guān)HIV控制的至關(guān)重要的線索：對早期診斷陽性的感染嬰兒及早治療能夠顯著性減少HIV的復(fù)制并保持相當(dāng)長的時間。同樣，在2014年逆轉(zhuǎn)錄病毒及伺機感染會議上，研究人員對另一位出生后4 h早期診斷為陽性的感染患兒進行抗病毒治療，嬰兒在1、3、9月齡時病毒載量檢測結(jié)果均小于最低檢測線[25]。上述這2例嬰兒早期的抗病毒治療效果提示嬰兒HIV感染檢測時間越早，越有利于及早治療，而及早實施抗病毒治療可以帶來良好的治療效果。因此，美國紐約州推薦嬰兒出生后立即或盡早進行檢測，WHO在其2013年最新版的《治療與預(yù)防HIV感染抗病毒藥物應(yīng)用指南》中，也建議所有5歲以下HIV暴露兒童應(yīng)盡早診斷和盡早開始抗病毒治療[26-27]。

目前我國正研究對HIV暴露嬰兒在其出生后及時采血，制備成濾紙片干血斑樣本進行HIV核酸檢測，濾紙片干血斑制備僅需80 μl血液，采集簡單，對嬰兒傷害小，易于保存和運輸，具有較高的敏感性和特異性[28]。該方法的應(yīng)用將為我國HIV暴露嬰兒盡早診斷，及時給予抗病毒治療，阻斷艾滋病母嬰傳播，乃至最終消除兒童HIV感染提供基本保證。

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（2015-11-02收稿 2015-12-02修回）

（責(zé)任編委 王永怡 本文編輯 張云輝）

Strategy and significance of early diagnosis laboratory detection in infants exposed to HIV

FAN Wen-cheng, YAO Jun*
National AIDS Reference Laboratory, National Center for AIDS/STD Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China

HIV-positive pregnant woman within 18 months born baby cannot be detected by serological testing of HIV infection, because of the passive acceptance of the HIV antibodies from the mother, So early diagnosis laboratory detection strategy of HIV exposed infants is different from the adults. At present, there is no uniform standard in the early diagnosis laboratory detection strategy internationally, but the detection strategy is generally consistent, slightly different. Recent studies have found that early antiviral therapy can significantly improve the outcome of HIV-infected infants and prolong their life. Therefore, early diagnosis becomes extremely important. In this paper, the current early diagnosis laboratory detection strategy of HIV exposed infants is reviewed for the early diagnosis of HIV exposure to infant infection status, carrying out early antiviral therapy and providing support for the elimination of children AIDS.

maternal-fetal exchange; HIV-1; early diagnosis

R563.12；R512.91

A

1007-8134(2016)06-0345-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.06.007

國家科技重大專項（2015ZX10001001-002）

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心艾滋病參比實驗室（范文成、姚均）

姚均，E-mail: yaojuncdc@163.com

*Corresponding author, E-mail: yaojuncdc@163.com