環(huán)糊精改性光子晶體分子印跡法檢測諾氟沙星

張 蓉，劉曉燕，余莉萍

（天津大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，天津 300072）

諾氟沙星又名氟哌酸，是第三代氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物，不但被廣泛應(yīng)用于臨床治療，近年來還被應(yīng)用于食用性動物疾病的預(yù)防和治療，對多種炎癥有著較好的療效。但它也存在著致胎兒畸形、損害腎功能等毒副作用，歐盟已經(jīng)限定了此類物質(zhì)在食品中的最大殘留限量［1］，因此控制并檢測其在環(huán)境或食品中的含量，對達到最佳治療效果及降低毒副作用具有非常重要的意義。目前文獻報道的諾氟沙星測定方法主要有電位法［2］、熒光光度法［3-4］和高效液相色譜法［5］等，這些方法都存在耗時長、需使用特殊或復(fù)雜儀器［2-5］等缺點。

近年來，分子印跡凝膠光子晶體（MIPP）［6-9］越來越受到人們的關(guān)注。它是將凝膠光子晶體與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，既可以利用凝膠光子晶體的結(jié)構(gòu)可控性，也可以實現(xiàn)印跡目標(biāo)分子的高度選擇性。反蛋白石結(jié)構(gòu)的分子印跡凝膠光子晶體是三維有序大孔材料，不僅具有大孔徑，還具有孔分布均一、有序、比表面積大、孔隙率高、孔徑柔性可調(diào)等特點［6］。將凝膠光子晶體與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，不僅賦予其對目標(biāo)分子的特異性識別性能，還能保證智能水凝膠的環(huán)境敏感性。更重要的是，凝膠發(fā)生溶脹或收縮的同時，光子晶體的晶格參數(shù)和禁帶結(jié)構(gòu)得到同步的調(diào)制，結(jié)合或釋放目標(biāo)分子的過程會伴隨著光子帶隙的移動，能觀察到衍射光譜或顏色的明顯變化。如果保持外界刺激，隨著溶液中目標(biāo)分子濃度的不斷加大，凝膠光子晶體能逐步溶脹，光子帶隙也隨之逐步移動，因此可以通過建立衍射峰與目標(biāo)分子濃度之間的定量關(guān)系，實現(xiàn)對特定目標(biāo)分子的非標(biāo)記傳感［7］。分子印跡凝膠光子晶體是一種性能優(yōu)異、普適性強、具有自表達特性的新型傳感器，目前已經(jīng)應(yīng)用于牛血清白蛋白［6］、香草醛［7］、有機磷［8］和四環(huán)素［9］等物質(zhì)的有效檢測。

雖然分子印跡凝膠光子晶體的分析應(yīng)用已經(jīng)取得了較大的進展，但由分子印跡凝膠光子晶體的制備原理可知，要想獲得高選擇性的光子晶體印跡薄膜，在分子印跡過程中功能單體與模板分子間的相互作用方式很重要。例如，以丙烯酰胺為功能單體的分子印跡過程主要是利用氫鍵的相互作用，但氫鍵在水相中很容易被水分子破壞，致使功能單體與模板分子間的相互作用大大減弱［10-11］。因此以丙烯酰胺為功能單體的分子印跡聚合物的制備及應(yīng)用絕大多數(shù)是在非水溶液中進行。然而，自然界中許多天然的識別系統(tǒng)以及MIPP所面臨的實際應(yīng)用環(huán)境多是水相體系，因此，尋找合適的功能單體實現(xiàn)水相分子印跡是一個亟需解決的問題。

β-環(huán)糊精（β-CD）是由 7個 D-吡喃葡萄糖單元通過α-1，4-糖苷鍵連接而成的腔內(nèi)疏水、腔外親水的環(huán)狀低聚糖。由于環(huán)糊精的疏水空腔能識別許多帶有疏水基團的化合物并與之形成主客體包合物［10］，并且 β-環(huán)糊精經(jīng)改性后可以疏水作用、范德華力或氫鍵等多種作用力形式與模板分子進行相互作用［12］，因此將環(huán)糊精應(yīng)用于分子印跡中將拓寬分子印跡的應(yīng)用范圍，進而實現(xiàn)水相中的分子印跡。日本的Komiyama課題組已利用環(huán)糊精為功能單體在水溶液中成功印跡了抗生素和寡肽［10］。

本實驗將順丁烯二酸酐改性的 β-環(huán)糊精和丙烯酸作為功能單體，過硫酸銨為引發(fā)劑，N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，在水溶液中制備了諾氟沙星印跡凝膠光子晶體。通過對分子印跡條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了對水溶液中諾氟沙星的快速、靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

掃描電鏡（Nova Nanosem 430，F(xiàn)EI）；紅外光譜儀（Perkin-Elmer 1600，PE）；光纖光譜儀（JKHQ-D1，天津市浩強電子有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（山東鄄城華魯儀器有限公司）；電子天平（BT-125D，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ2200B，昆山市超儀器有限公司）；多功能電動攪拌器（WH-8401-60，天津市威華實驗室儀器廠）；電熱真空干燥箱（DZG-4018，天津市天宇實驗儀器有限公司）。

諾氟沙星（NOR）（分析純，美國百靈威公司），環(huán)丙沙星（CIP）（分析純，天津市光復(fù)有限公司），二者均用3%的醋酸溶液作溶劑配制一系列濃度的溶液。β-環(huán)糊精（β-CD）、順丁烯二酸酐（MAH）、三氯甲烷、N，N’-二甲基 甲 酰 胺 （DMF）、丙 烯 酰 胺（AMD）、丙烯酸（AA）、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS）、過硫酸銨（APS）、冰醋酸等均為分析純，購自天津大學(xué)科威公司。實驗用水均為二次蒸餾水。β-CD，NOR，CIP的結(jié)構(gòu)式見圖1。

1.2 M IPP的制備

1.2.1 光子晶體模板的制備

參照文獻采用乳液聚合法制備單分散的聚苯乙烯（PS）微球［13］。將一定量制備好的單分散 PS微球懸濁液置于潔凈的平底容器中，將經(jīng)過預(yù)處理的潔凈的載玻片垂直插入其中，將其固定，置于43℃水浴中，保證環(huán)境安靜不被打擾，隨著燒杯中水的揮發(fā)，單分散微球會在毛細力作用下在豎直的載玻片上自組裝，待溶劑徹底揮發(fā)完之后便可得到平整且光色鮮亮的光子晶體模板。將覆蓋光子晶體模板的載玻片輕輕從容器中取出，置于80℃的烘箱中，干燥，自然降溫后，便可得到牢固的光子晶體模板。

圖1 環(huán)丙沙星、諾氟沙星、β-環(huán)糊精的分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Molecular structures of ciprofloxacin，norfloxacin and β-cyclodextrin

1.2.2 M AH修飾β-CD的合成

乙烯羧基修飾的β-CD的合成方法參照文獻［14-15］。將 5.68 gβ-CD（0.005 mol）和 4.9 g MAH（0.05 mol）溶于30 mL干燥的 DMF中，二者在80℃下恒溫反應(yīng)10 h。待反應(yīng)物冷卻至室溫后，向體系中加入三氯甲烷，析出白色沉淀，真空抽濾，粗產(chǎn)品（濾餅）用 V（丙酮）∶V（蒸餾水） =1∶19溶液進行充分洗滌，真空在80℃干燥后得順丁烯二酸酐改性β-CD（MAH-β-CD）。

1.2.3 諾氟沙星分子印跡凝膠光子晶體的制備

稱取0.319 g諾氟沙星溶于2 mL 3%醋酸溶液中，然后分別加入 0.5 g MAH-β-CD、3 mL丙烯酸、0.1 g BIS及0.15 g APS，均勻混合后滴加到 PS光子晶體模板的上邊緣。待溶液通過毛細力和重力作用緩慢滲透至整個模板中，在55℃的烘箱中聚合5 h，便得到蛋白石結(jié)構(gòu)的凝膠光子晶體。然后，將得到的蛋白石印跡凝膠光子晶體先置于二甲苯中超聲除去聚苯乙烯光子晶體模板，再用十二烷基硫酸鈉的 V（醋酸）∶V（甲醇）=1∶9溶液除去分子印跡模板諾氟沙星，蒸餾水清洗后得到反蛋白石結(jié)構(gòu)的諾氟沙星印跡凝膠光子晶體。非印跡凝膠光子晶體（NIPP）的制備方法除不加諾氟沙星外，其它條件相同。

1.3 表征方法

本實驗用Nanosem 430型場發(fā)射掃描電鏡來表征蛋白石結(jié)構(gòu)分子印跡凝膠光子晶體和反蛋白石結(jié)構(gòu)凝膠光子晶體的形貌特征。順丁烯二酸酐改性β-CD結(jié)構(gòu)用 Perkin-Elmer 1600型紅外光譜儀測定。

1.4 諾氟沙星分子印跡凝膠光子晶體的響應(yīng)性測定

按照濃度從低到高的順序，將制得的 MIPP膜依次浸入諾氟沙星的醋酸溶液中，并用光纖光譜儀記錄其在不同濃度溶液中衍射峰的位置。測定響應(yīng)時間時，把 MIPP薄膜浸入濃度為10-6mol/L的諾氟沙星醋酸溶液中，利用光纖光譜儀每隔10 s測試和記錄1次光子晶體衍射峰位置。待衍射峰的位置不再發(fā)生變化時，說明印跡凝膠光子晶體對模板分子諾氟沙星的吸附已經(jīng)達到了平衡狀態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 M AH-β-CD的紅外光譜分析

為了得到水溶性好且能與丙烯酸交聯(lián)聚合的改性環(huán)糊精，實驗中使用順丁烯二酸酐對β-CD進行修飾，合成了帶有雙鍵和羧基的環(huán)糊精衍生物，圖2為其紅外光譜圖。由圖2可以看出，3387cm-1為-OH伸縮振動吸收峰，2930cm-1為-CH2的反對稱伸縮振動吸收峰，1729cm-1為伸縮振動吸收峰，1647cm-1為的伸縮振動吸收峰，說明我們成功地將和引入到了β-CD上，實現(xiàn)了環(huán)糊精的改性。

2.2 諾氟沙星分子印跡凝膠光子晶體的制備

分子印跡凝膠光子晶體的制備主要包括以下幾個過程：1）垂直沉積法制備光子晶體模板；2）毛細力滲透法將含有模板分子的前驅(qū)液填充到光子晶體模板中，引發(fā)聚合；3）去除光子晶體模板，制備反蛋白石結(jié)構(gòu)；4）洗脫模板分子，得到分子印跡凝膠光子晶體。為了得到特異性高的印跡凝膠光子晶體，功能單體的選擇十分重要。功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑用量的不同也會使得印跡薄膜的性能不同。實驗中我們選擇了 MAH改性的β-CD和丙烯酸作為功能單體，優(yōu)化了功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑的用量，最終采用 0.5 g MAH-β-CD、0.0319 g諾氟沙星、3 mL丙烯酸、0.1 g BIS及0.15 g APS制備分子印跡聚合物。在55℃時熱引發(fā)聚合后的凝膠光子晶體表面平整，呈現(xiàn)出鮮艷的結(jié)構(gòu)顏色。

圖2 MAH-β-CD的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectrum of MAH-β-CD

實驗中使用二甲苯超聲除去光子晶體模板，再分別用2%十二烷基硫酸鈉的V（醋酸）∶V（甲醇）=1∶9溶液和蒸餾水多次清洗除去印跡模板分子諾氟沙星。由電鏡照片可以看出，蛋白石結(jié)構(gòu)的凝膠光子晶體具有三維有序的面心立方結(jié)構(gòu)［圖3a）］；去除光子晶體模板和印跡模板分子后，反蛋白石結(jié)構(gòu)印跡凝膠光子晶體中的聚苯乙烯微球已經(jīng)完全去除，呈現(xiàn)了三維有序相互連通的大孔結(jié)構(gòu)［圖3b）］。

圖3 蛋白石結(jié)構(gòu)的凝膠光子晶體和反蛋白石結(jié)構(gòu)印跡凝膠光子晶體的SEM照片F(xiàn)ig.3 SEM images of opal MIPP and inverse opal MIPP

2.3 分子印跡凝膠光子晶體的響應(yīng)性能

2.3.1 響應(yīng)時間

實驗結(jié)果表明MIPP膜對諾氟沙星的響應(yīng)速度很快，在1min內(nèi)就達到了平衡狀態(tài)（圖4）。這是由于反蛋白石光子晶體規(guī)則的三維有序相互連通的柔性孔結(jié)構(gòu)能充分保證識別位點的可接近性和分子擴散的無阻礙性。此外，由于比表面積的增大，更多的識別位點暴露在表面，有利于與外來的目標(biāo)分子相結(jié)合，實現(xiàn)快速響應(yīng)。

圖4 印跡凝膠光子晶體在10-6 m ol/L諾氟沙星溶液中衍射波長隨時間的關(guān)系曲線Fig.4 Time dependence of MIPP in 10-6 mol/L norfloxacin solution

2.3.2 選擇性

實驗中測試了諾氟沙星印跡凝膠光子晶體薄膜的傳感特性。將薄膜放置在一系列濃度的諾氟沙星溶液中，我們發(fā)現(xiàn)隨著諾氟沙星溶液濃度的增加，MIPP薄膜的衍射峰逐漸地紅移。當(dāng)濃度從10-9mol/L增加到10-4mol/L時，衍射峰從633 nm紅移到了722 nm（圖5），說明 MIPP薄膜對模板分子諾氟沙星有很好的響應(yīng)性。

圖5 印跡凝膠光子晶體（M IPP）在濃度為10-9～10-4 m ol/L的諾氟沙星溶液中衍射波長的變化Fig.5 Dependence of the diffraction wavelength of MIPP in response to norfloxacin in the range of 10-9 to 10-4 mol/L

將非印跡光子晶體膜（NIPP）也浸入不同濃度的諾氟沙星溶液中，結(jié)果見圖6。

由圖6可以看出，隨著諾氟沙星濃度的增加，非印跡薄膜的衍射峰沒有呈現(xiàn)出明顯的移動。這說明上述實驗中其衍射峰的紅移是由于分子印跡過程而引起的。

為了進一步驗證諾氟沙星印跡凝膠光子晶體膜的特異選擇性，實驗中選擇了與諾氟沙星結(jié)構(gòu)類似的喹諾酮類物質(zhì)環(huán)丙沙星進行比較，結(jié)果見圖7。

圖6 非印跡凝膠光子晶體（NIPP）在濃度為10-9～10-4 mol/L的諾氟沙星溶液中衍射波長的變化Fig.6 Dependence of the diffraction wavelength of NIPP in response to norfloxacin in the range of 10-9 to 10-4 m ol/L

圖7 印跡凝膠光子晶體在濃度為10-9～10-4 m ol/L的環(huán)丙沙星溶液中衍射波長的變化Fig.7 Dependence of the diffraction wavelength of MIPP in response to ciprofloxacin in the range of 10-9 to 10-4 mol/L

由圖7可以看出，隨著環(huán)丙沙星濃度的增加，MIPP薄膜的衍射峰并沒有出現(xiàn)明顯的移動，這是由于M IPP薄膜形成的結(jié)合位點在大小和形狀上只與目標(biāo)分子諾氟沙星相吻合，因此對環(huán)丙沙星不能形成特異性響應(yīng)，也就不能引起其衍射峰明顯的移動。

2.4 傳感機理初探

由于β-CD具有疏水空腔，可以與一些疏水性的基團形成主客體包合物，因此諾氟沙星的疏水部分可以進入β-CD的空腔內(nèi)，二者在水溶液中通過疏水相互作用實現(xiàn)結(jié)合，實現(xiàn)有效識別。此外，MAH-β-CD和丙烯酸的羧基也可以與諾氟沙星通過氫鍵作用力形成復(fù)合物［16］。所以，分子印跡過程疏水作用和氫鍵作用形成的多重反應(yīng)位點和高密度的有效識別位點使得MIPP膜對諾氟沙星形成特異性傳感。

3 結(jié)論

將光子晶體與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，將具有疏水空腔的MAH改性的環(huán)糊精作為一種新型的功能單體，在水相中制備了諾氟沙星印跡凝膠光子晶體。該方法低毒、環(huán)保、簡便、靈敏，為水相中諾氟沙星的檢測提供了一種新思路。

［1］Caro E，MarcéR M，Cormack PA G，et al.Novel enrofloxacin imprinted polymer applied to the solid-phase extraction of fluorinated quinolones from urine and tissue samples［J］.Anal Chim Acta，2006，562（2）：145-151

［2］Moreira F C，F(xiàn)reitas V P，Sales M F.Biomimetic norfloxacin sensorsmade ofmolecularly-imprinted materials for potentiometric transduction［J］.M icrochim Acta，2011，172（1/2）：15-23

［3］Córdoba-Borrego M，Córdoba-Díaz M，BernabéI，et al.Determination of norfloxacin by fluorescence in the presence of different antacids：Quantification of analytical interferences［J］.JPharm Biomed Anal，1996，14（8/10）：977-982

［4］Vílchez J L，Ballesteros O，Taoufiki J，et al.Determ ination of the antibacterial norfloxacin in human urine and serum samples by solid-phase spectrofluorimetry［J］.Anal Chim Acta，2001，444（2）：279-286

［5］Kassab N M，Singh A K，Kedor-Hackmam E R M，et al.Quantitative determination of ciprofloxacin and norfloxacin in pharmaceutical preparations by high performance liquid chromatography［J］.Braz J Pharm Sci，2005，41（4）：507-513

［6］Hu X，Li G，Huang J，et al.Construction of self-reporting specific chemical sensors with high sensitivity［J］.Adv Mater，2007，19（24）：4327-4332

［7］Peng H，Wang S，Zhang Z，et al.Molecularly imprinted photonic hydrogels as colorimetric sensors for rapid and label-free detection of vanillin［J］.J Agric Food Chem，2012，60（8）：1921-1928

［8］Liu F，Huang S，Xue F，et al.Detection of organophosphorus compounds using amolecularly imprinted photonic crystal［J］.Biosens Bioelectron，2012，32 （1）：273-277

［9］Wang L，Lin F，Yu L.A molecularly imprinted photonic polymer sensor with high selectivity for tetracyclines analysis in food［J］.Analyst，2012，137（15）：3502-3509

［10］Asanuma H，Akiyama T，Kajiya K，et al.Molecular imprinting of cyclodextrin in water for the recognition of nanometer-scaled guests［J］.Anal Chim Acta，2001，435（1）：25-33

［11］Xu Z，Xu L，Kuang D，et al.Exploitingβ-cyclodextrin as functional monomer in molecular imprinting for achieving recognition in aqueous media［J］.Mater Sci Eng C，2008，28（8）：1516-1521

［12］Hishiya T，Akiyama T，Asanuma H，et al.Molecular imprinting of cyclodextrins leading to synthetic antibodies［J］.J Incl Phenom Macro，2002，44 （1/4）：365-367

［13］Lin F，Yu L.Thiourea functionalized hydrogel photonic crystal sensor for Cd2+detection［J］.Anal Methods，2012，4（9）：2838-2845

［14］Liu Y，F(xiàn)an X.Synthesis and characterization of pH-and temperature-sensitive hydrogel of N-isopropylacrylamide/cyclodextrin based copolymer［J］.Polymer，2002，43（18）：4997-5003

［15］Liu X，F(xiàn)ang H，Yu L.Molecularly imprinted photonic polymer based onβ-cyclodextrin for amino acid sensing［J］.Talanta，2013，116：283-289

［16］Liu W，Wang B.Preparation and application of norfloxacin-M IP/polysulfone blending molecular imprinted polymermembrane［J］.JAppl Polym Sci，2009，113（2）：1125-1132