基于隨機采樣的快速超分辨熒光成像技術(shù)研究及其樣機實現(xiàn)

宓現(xiàn)強 中國科學(xué)院上海高等研究院

基于隨機采樣的快速超分辨熒光成像技術(shù)研究及其樣機實現(xiàn)

宓現(xiàn)強 中國科學(xué)院上海高等研究院

光學(xué)顯微成像技術(shù)具有無損、非接觸、高特異性、高靈敏、高活體友好以及能夠提供功能信息等突出優(yōu)點，在生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。并且由于其具有三維層析成像能力，可借助熒光標記等其他技術(shù)手段對于樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和生化反應(yīng)進行針對性的觀察，是獲知生物體結(jié)構(gòu)、形貌以及臨床醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域非常重要的工具。近年來隨著生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，迫切需要一種既具有納米尺度的光學(xué)分辨本領(lǐng)，還可以連續(xù)監(jiān)測生物大分子和細胞器微小結(jié)構(gòu)、功能的演化，同時不影響生物體系生物活性的光學(xué)成像顯微技術(shù)。然而傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像技術(shù)的空間分辨率受衍射極限的限制，無法做到小于200nm分辨率，只能觀測到微米至亞微米級的結(jié)構(gòu)形貌。

為了突破光學(xué)顯微成像技術(shù)的衍射極限，科學(xué)家不斷地尋找新的方法來提高顯微成像技術(shù)的分辨率。1957年，Marvin Minsky在哈佛大學(xué)最早提出了共聚焦（Confocal）的概念，并對載物臺掃描共聚焦顯微鏡申報了美國國家專利（US Pat. 3013467）。1987年出現(xiàn)了第一臺激光掃描共聚焦顯微鏡商業(yè)產(chǎn)品。至此，共聚焦顯微技術(shù)已基本發(fā)展到比較成熟的階段。然而，共焦顯微鏡的分辨率只是在寬場顯微鏡上提升約1.4倍，仍然不能突破光學(xué)衍射極限。近年來，Stefan W. Hell等人[1,2]提出的STED和基態(tài)倒空（Ground state depletion，GSD）熒光成像技術(shù)，莊小威等人[3]提出的STORM技術(shù)，Eric Betzig等人[4]和Samuel T. Hess等人[5]提出的光激活定位超分辨成像方法（Photo-activated localization microscopy，PALM），突破了光學(xué)衍射極限的限制，使光學(xué)顯微鏡的成像分辨能力提高到幾十納米。為此，2014年諾貝爾化學(xué)獎頒給了在光學(xué)超分辨分子成像技術(shù)中做出突出貢獻的有關(guān)科學(xué)家。

STORM技術(shù)是利用了熒光探針具有光開關(guān)的特性，用特定波長的激光來激活探針，然后用另一個波長激光來觀察、精確定位以及漂白熒光分子，將此過程循環(huán)足夠多次后重構(gòu)得到高分辨率圖像的方法。由于具有激發(fā)強度小、寬場分辨能力高、熒光染料適用性強等特點，STORM技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究。在細胞生物研究中，STORM技術(shù)實現(xiàn)了對亞細胞組織結(jié)構(gòu)（例如微管、肌動蛋白和線粒體等）的高精度觀察。如Bates等人[6]利用STORM 觀察了BS-C-1細胞的線粒體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，分辨出重疊或者之前的顯微技術(shù)不能分解的細絲。在神經(jīng)生物學(xué)研究中，STORM技術(shù)提供了研究只有幾十納米的神經(jīng)突觸的構(gòu)型以及信息相互傳遞的新方法。例如，Dani等人[7]利用STORM技術(shù)研究了神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)軸突傳遞的方式以及神經(jīng)突觸在神經(jīng)細胞上的分布。Xu等人[8]利用STORM 技術(shù)對神經(jīng)元中發(fā)揮重要作用的肌動蛋白和血影蛋白在軸突和樹突的組織結(jié)構(gòu)進行了高分辨成像。在微生物研究領(lǐng)域中，STORM技術(shù)提供了對極小尺寸的細菌、病毒等的結(jié)構(gòu)、功能及機制研究的高分辨成像方法。Wang等人[9]用STORM技術(shù)發(fā)現(xiàn)了細菌中H-NS蛋白與DNA結(jié)合并在染色體中形成緊湊的聚集體。

相比于國外，國內(nèi)高端光學(xué)顯微鏡的研究起步較晚。直到90年代初，我國才引進第一臺激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）。2011年中科院生物物理研究所引進了國內(nèi)第一臺基于結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微技術(shù)（Structured Illumination Microscopy，SIM）的超分辨顯微鏡（美國API公司OMX）。目前，國內(nèi)對高端顯微鏡（如共聚焦顯微鏡）的需求每年以20%的量增加，全部依靠進口。最近十年來，一些重點院校研究所，如浙江大學(xué)，中國科技大學(xué)，北京大學(xué)、華中科技大學(xué)、深圳大學(xué)、上海理工大學(xué)、中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機械研究所、中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所等逐漸開展了在超分辨顯微技術(shù)領(lǐng)域的研究。

鑒于STORM技術(shù)的巨大價值和應(yīng)用前景，圍繞著STORM技術(shù)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用和技術(shù)不斷完善，國內(nèi)許多機構(gòu)也紛紛開展了相關(guān)研究。深圳大學(xué)光電工程學(xué)院的牛憨笨院士研究團隊[10]采用了雙物鏡聚焦設(shè)計了STORM結(jié)構(gòu)，抑制了焦平面外的熒光干擾，提高了單分子的定位精度，加大了系統(tǒng)的景深。上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院的孫潔林課題組[11]采用汞燈代替激光光源，設(shè)計了STORM，實現(xiàn)了30nm的橫向分辨率。中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所熊大曦課題組[12,13]通過分析柱透鏡參數(shù)選擇上的優(yōu)劣，優(yōu)化并提高了STORM軸向定位的精度和深度。

STORM技術(shù)超高空間分辨率的能力主要依賴于極高的單分子定位精度，即在采集圖像時，對應(yīng)每一幀圖像只能激活少量熒光分子。但其缺點是為了收集足夠多的光子數(shù)來重構(gòu)一幅完整的圖像，通常需要幾千幀的采樣數(shù)，導(dǎo)致采樣效率被約束。同時，當獲得數(shù)據(jù)后進行單分子擬合等數(shù)據(jù)處理時，通常也需要幾分鐘至幾十分鐘（針對不同的樣品甚至需要幾小時）來得到一幅高分辨圖像。這對生物體內(nèi)的生理病理發(fā)生發(fā)展過程，如病毒入侵、細胞的胞飲胞吞及物質(zhì)進入細胞后的途徑等進行實時動態(tài)觀察來說是遠遠不夠的。而這些過程恰恰對人們更加直觀的理解生命現(xiàn)象，揭示各種疾病的發(fā)病機理具有重要的意義。

提高STORM技術(shù)成像速度的解決途徑主要有兩種：一是在同等采樣幀數(shù)下，加快采樣速率，從而提高成像速度。這就需要增大激發(fā)光的強度、縮短熒光染料的光開關(guān)時間、使用更加快速的探測器。這類方法是傳統(tǒng)STORM系統(tǒng)的進一步優(yōu)化，然而較高的激發(fā)光強度會引起樣品的損害，不利于對生物樣品活性功能的觀察，而且由于采樣幀數(shù)沒有減少，并不能提高基于傳統(tǒng)單分子擬合的圖像重構(gòu)速度。二是減少圖像重構(gòu)所需的采樣幀數(shù)。這就需要增大熒光分子的激發(fā)密度，使得每幀可以累積更多的單分子事件來減少采樣幀數(shù)。在較高的激發(fā)密度下，傳統(tǒng)單分子擬合定位算法便不再適用，以此而發(fā)展起來的多分子擬合算法雖然可以提高熒光分子的定位精度，但是在圖像重構(gòu)速度方面還是較慢。

為解決這一關(guān)鍵前沿技術(shù)問題，中科院上海高等研究院宓現(xiàn)強研究團隊、王中陽研究團隊及中科院光機所韓申生研究團隊聯(lián)合上海市公共衛(wèi)生臨床中心申請的“基于隨機采樣的快速超分辨熒光成像技術(shù)研究及其樣機實現(xiàn)研究”項目獲得2016年國家重點研發(fā)計劃“數(shù)字診療裝備研發(fā)”專項支持（項目編號2016YFC0100600），擬在上述領(lǐng)域獲得突破。具體內(nèi)容包括發(fā)展基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的高效率熒光探針，從物理采樣模式上進行革新，將壓縮感知的隨機采樣（Random Sampling，RS）模式運用于STORM成像技術(shù)中，大幅度減少原有的采樣幀率，使得成像效率可以得到數(shù)量級的提升；搭建與集成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的RSSTORM樣機，并且將此樣機用于乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）入侵肝細胞的實驗觀察和驗證。

[1] S. W. Hell and J. Wichmann, Opt. Lett. 19,780(1994).

[2] S. W. Hell and M. Kroug, Appl. Phys. B 60,495(1995).

[3] M. J. Rust, et al., Nat. Meth. 3,793(2006).

[4] E. Betzig, et al., Science 313,1462(2006).

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[6] Bates, M. ; Huang, B. ; Dempsey, G. T., Science. 317,1749-53(2007).

[7] Dani, A. ; Huang, B. ; Bergan, J. ; Dulac, C., Neuron. 68,843-56(2010).

[8] Xu, K. ; Zhong, G. ; Zhuang, X., Actin, Science. 339,452-6(2013).

[9] Wang, W. ; Li, G. W. ; Chen, C. ; Xie, X. S. ; Zhuang, X., Science. 333,1445-9(2011).

[10] Chen D, Yu B, Qu J, Niu H Opt. Lett. 35 886(2010).

[11] Zhai Ren-kuan, et al., J. Chin. Electr. Microsc. Soc. 30,527-532(2011).

[12] Zhang Shi-chao, et al., Acta Photonica Sinica. 44,1017003(2015).

[13] Yang Guang, et al., Acta Biophysica sinica. 30,380-390(2014).