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    豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白的研究進(jìn)展

    2016-02-03 10:05:13宋淑英張澤輝王莊徐煒閆明
    湖北畜牧獸醫(yī) 2015年12期
    關(guān)鍵詞:半胱氨酸豬瘟抗原

    宋淑英++張澤輝++王莊++徐煒++閆明

    摘要:對豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行了綜述,進(jìn)一步弄清了豬瘟病毒的結(jié)構(gòu),為豬瘟病毒的研究提供理論支撐。

    關(guān)鍵詞:豬;豬瘟病毒;研究進(jìn)展

    中圖分類號:S852.65+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B 文章編號:1007-273X(2015)12-0007-03

    豬瘟由豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起,是在豬間流行的一種重要傳染病?;钾i會出現(xiàn)運(yùn)動失調(diào)、后肢無力、高熱、皮膚出現(xiàn)出血點(diǎn)或出血斑等癥狀[1]。該病致死率高且難以清除,隱性感染或治愈豬通常會成為潛在感染源。在被感染豬的多個器官,如扁桃體、皮膚、淋巴、脾臟等,都能夠檢測出豬瘟病毒。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國每年因豬瘟而造成的損失高達(dá)100億元以上[2]。

    豬瘟造成的危害巨大,而其病原致病性,主要是通過病毒基因組RNA所編碼的蛋白實(shí)現(xiàn)的。研究表明,CSFV的基因組RNA主要由3部分組成,分別為3′非編碼區(qū)(3′-untranslated region, 3′UTR)、5′非編碼區(qū)(5′-untranslated region, 5′UTR)以及一個較大的開放閱讀框(ORF)[3]。在ORF編碼產(chǎn)生的蛋白中,結(jié)構(gòu)蛋白與病毒致病、免疫,以及防控疫苗研制等方面關(guān)系最為密切。本對CSFV結(jié)構(gòu)蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹,為探明病毒致病機(jī)理,更好防控豬瘟提供理論依據(jù)。

    1 ORF

    CSFV的ORF位于病毒的5′UTR與3′UTR之間。病毒基因組RNA全長約為12.3 kB,其大部分為ORF。該ORF編碼一個由3 898個氨基酸所構(gòu)成的多聚蛋白(polyprotein,PPro)。該蛋白能夠被宿主細(xì)胞的信號肽酶及病毒自身合成的蛋白酶所識別、加工[4],進(jìn)而被分解為12種蛋白質(zhì)。按照編碼各種蛋白質(zhì)基因的順序,12種蛋白分別為Npro、C、Erns(E0)、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B。其中C、Erns、E1及E2為病毒結(jié)構(gòu)蛋白[5],其余8種為非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白共同作用,參與病毒復(fù)制、傳播等過程。

    2 CSFV結(jié)構(gòu)蛋白

    2.1 C蛋白

    CSFV C蛋白,也稱核衣殼蛋白C。編碼該蛋白的基因大小為192 bp,是由PPro經(jīng)宿主細(xì)胞中的信號肽酶加工而成。構(gòu)成該蛋白的氨基酸具有較強(qiáng)的親水性。序列分析發(fā)現(xiàn),組成該蛋白的多為帶正電荷的精氨酸及賴氨酸殘基,推測可能與基因組RNA結(jié)合作用有關(guān)[6]。最近的研究發(fā)現(xiàn),C蛋白在黃病毒科中的丙型肝炎病毒中,具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用。C蛋白能夠有效的抑制基因組中核糖體結(jié)合位點(diǎn)的活性,使病毒的復(fù)制、翻譯過程受到抑制,降低病毒的增殖效率,呈現(xiàn)持續(xù)感染的狀態(tài)。但C蛋白在CSFV中是否存在同樣功能尚不清楚。

    2.2 Erns

    Erns蛋白存在于PPro的268~494位,由227個氨基酸殘基構(gòu)成,分子量為44~48 kDa之間。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),該蛋白具有9個潛在的糖基化位點(diǎn),在病毒粒子中,通常以同源二聚體的形成存在[7],二聚體分子量約為100 kDa。被感染的細(xì)胞能夠分泌大量的Erns蛋白。

    對Erns功能研究發(fā)現(xiàn),該蛋白除是一種囊膜蛋白外,同時具有核糖核酸酶活性,對尿嘧啶具有較高專一性。在pH 6.0~6.5時活性最高,Mn2+與Zn2+為酶活性強(qiáng)抑制劑,Ca2+與Mg2+對其抑制作用較弱。該蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性,50~60 ℃時活性最強(qiáng),在65 ℃時仍能夠保持75%的酶活性,而在37 ℃時的活性能夠保持在86%左右[8]。

    Erns具有免疫抑制活性,同時具有一定神經(jīng)毒性及抗蠕蟲能力。蛋白的297位及346位氨基酸為酶活性必需氨基酸,該位點(diǎn)氨基酸發(fā)生突變后,Erns將失去核糖核酸酶活性,但仍能與相應(yīng)抗體結(jié)合。研究表明,Erns的核糖核酸酶活性在CSFV復(fù)制過程中具有重要作用,與自然宿主長期帶毒及隱性感染有關(guān)。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Erns對不同種屬的淋巴細(xì)胞蛋白合成均有較強(qiáng)的抑制作用,尤其是對人、豬、羊和牛的淋巴細(xì)胞增殖,能夠完全抑制其增殖[9]。在Erns蛋白346位的組氨酸對CSFV的致病性具有決定性作用,當(dāng)該位點(diǎn)發(fā)生氨基酸突變時,病毒的致病力將完全消失,突變病毒雖能夠在細(xì)胞中穩(wěn)定傳代,但產(chǎn)毒量顯著降低。在病毒侵入細(xì)胞的過程中,Erns也發(fā)揮了重要作用。研究表明,Erns蛋白能夠與位于細(xì)胞表面的膜蛋白相互作用。在豬腎細(xì)胞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),CSFV與腎細(xì)胞結(jié)合是通過Erns蛋白與細(xì)胞表面中的硫酸乙酰肝素相互作用而實(shí)現(xiàn)的[10]。

    Erns蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生對CSFV的免疫能力。由于編碼Erns蛋白的核苷酸序列保守性相對較高,因此Erns可作為免疫防控豬瘟的靶蛋白。Erns的抗原決定簇可分為3個區(qū)域,AR1,AR2及AR3。3個區(qū)域單獨(dú)或共同都可以與感染CSFV的血清發(fā)生反應(yīng)。對Erns蛋白高級結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),與其他核糖核酸酶不同,Erns具有一個C-端延伸區(qū)域、一個截短的N-端以及一個大的富含半胱氨酸的插入?yún)^(qū)域。其中C-端延伸區(qū)域和蛋白的跨膜定位有關(guān)[11]。

    2.3 E1

    E1蛋白是CSFV的囊膜糖蛋白,位于PPro的495~689位氨基酸之間,由195個氨基酸殘基構(gòu)成,蛋白骨架的分子量約為21.8 kDa。有3個潛在的N-糖基化位點(diǎn)。E1蛋白是由糖基化酶、宿主細(xì)胞的信號肽酶及蛋白水解酶共同加工、成熟的。E1和E2蛋白可以通過二硫鍵構(gòu)成異源的二聚體。E1存在于病毒囊膜內(nèi),無法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CSFV中和抗體[5]。

    2.4 E2

    E2蛋白同樣為病毒的囊膜糖蛋白,但與E1蛋白不同,E2是CSFV的主要保護(hù)性抗原蛋白。該蛋白由370個氨基酸殘基構(gòu)成,分子量約為41.5 kDa。蛋白位于PPro的690~1 060位氨基酸,存在5個潛在糖基化位點(diǎn),每個位點(diǎn)都可以與分子量為2 kDu~3 kDa的低聚糖結(jié)合[12]。在蛋白N-端存在4個主要抗原位點(diǎn),其上游為一段信號肽序列,C-端為一個由18個氨基酸組成的疏水側(cè)鏈而構(gòu)成的跨膜蛋白。E2蛋白同E1蛋白一樣,通常以二聚體形式存在于CSFV感染的細(xì)胞表面及病毒粒子內(nèi)。

    E2蛋白含有刺激產(chǎn)生病毒中和抗體的抗原決定簇,可刺激機(jī)體產(chǎn)生針對CSFV的中和抗體。研究發(fā)現(xiàn),E2蛋白抗原區(qū)域均存在于蛋白的N-端和690~866位氨基酸殘基區(qū)間,共包括4個部分,即A、B、C和D。而蛋白的其他區(qū)域不參與形成抗原表位構(gòu)象。A區(qū)又可以分為3個亞區(qū),A1,A2和A3。在這些區(qū)域中,A1,A2保守性較高,B、C、D及A3容易發(fā)生變異。A1,B和C區(qū)為中和性抗原表位。另外,在E2蛋白的羧基端995~998位處,是一個以YYEP為核心序列的線性表位,該表位在整個瘟病毒屬中具有較高的同源性,為瘟病毒屬所共有的抗原表位。保護(hù)性試驗(yàn)表明,由A,B,C,D 4個抗原區(qū)域中任一區(qū)域誘導(dǎo)的免疫反應(yīng),都能夠使豬獲得對CSFV強(qiáng)毒株的免疫能力[13]。

    位于E2蛋白829~837位的氨基酸序列在CSFV中具有較高的保守性,而與瘟病毒屬中的其他病毒差異性則較大。因此可根據(jù)該段序列設(shè)計(jì)針對性的診斷及免疫試劑。而位于E2 N-端690~812位的123個氨基酸殘基中,推測含有與IgG結(jié)合區(qū)域,該區(qū)域與其他瘟病毒無交叉反應(yīng)[14],可用于CSFV血清學(xué)檢測。

    在E2蛋白中共有15個半胱氨酸,其中位于蛋白N-端的6個半胱氨酸在蛋白形成正確折疊構(gòu)象中起重要作用。位于695和737位的半胱氨酸是B及C區(qū)與單抗結(jié)合的必需基團(tuán),而位于792、818及856位的半胱氨酸與A區(qū)及D區(qū)的抗體結(jié)合有關(guān)。因此推測,可將E2蛋白的抗原性分為兩個相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單元,一個由B區(qū)和C區(qū)構(gòu)成的保守性相對較低的單元,另一個由A區(qū)和D區(qū)構(gòu)成的高度保守單元。其中B區(qū)與C區(qū)通過2個靠近N-端的半胱氨酸形成的二硫鍵連接,A區(qū)與D區(qū)則通過其他3個半胱氨酸形成的2對二硫鍵連接[15]。

    E2蛋白與CSFV對宿主細(xì)胞的識別與吸附能力有關(guān),能夠決定病毒對細(xì)胞的感染傾向性。研究發(fā)現(xiàn),E2蛋白能夠與宿主細(xì)胞膜中的低密度脂蛋白受體結(jié)合。而對病毒結(jié)構(gòu)蛋白E1、E2和Erns研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)只存在E1和E2蛋白時,病毒就可以感染細(xì)胞,Erns為病毒感染的非必需蛋白。在結(jié)構(gòu)蛋白中E2蛋白比較容易發(fā)生變異,而E2功能又與病毒感染以及抗體生成有關(guān),因此E2的變異性,能夠使CSFV對環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性,同時又能使免疫疫苗失效[11~13]。

    3 展望

    豬瘟病毒對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大威脅,但其具體的致病機(jī)制仍不明確。目前,疫苗免疫仍是防控豬瘟最有效的方式之一。而隨著對病毒基因組RNA及相關(guān)蛋白研究的不斷深入,使探明病毒致病機(jī)制、有效防控豬瘟成為可能。在CSFV結(jié)構(gòu)蛋白中,E2蛋白由于與免疫應(yīng)答有關(guān),對其結(jié)構(gòu)及功能的研究比較深入。同時,隨著對病毒其他結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能的不斷研究,防控豬瘟的思路和方法也將逐漸拓寬。

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