我國鵝細(xì)小病毒免疫學(xué)研究進(jìn)展

杜翔宇，李溫明，胡振林，張?zhí)鹛穑饘W(xué)，董　浩

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.鐵嶺出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 鐵嶺 112616；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118）

我國鵝細(xì)小病毒免疫學(xué)研究進(jìn)展

杜翔宇1，李溫明2，胡振林1，張?zhí)鹛?，胡桂學(xué)3，董浩1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.鐵嶺出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 鐵嶺 112616；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118）

鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）是小鵝瘟的病原體，GPV是一種單股的DNA病毒，從分類學(xué)角度講GPV屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒亞科。小鵝瘟是由GPV引起的一種高度接觸性急性或亞急性敗血性的傳染病，腸道栓塞為小鵝瘟特征性病變，通過排泄物和代謝分泌物排毒，傳播并且擴(kuò)散到空氣環(huán)境中，飼料和水極其受到污染，經(jīng)消化道引起本病迅速傳播，小鵝瘟具有較高的死亡率和較強(qiáng)的傳染性，7日齡以內(nèi)的雛鵝非常容易受到感染。小鵝瘟每年在我國不同地區(qū)都有不同程度的發(fā)生，當(dāng)在一個(gè)區(qū)域流行發(fā)生后，通常會(huì)間隔1-2年或者更長的時(shí)間再次發(fā)生，流行有一定周期性，疾病暴發(fā)后隱性感染的剩余鵝群得到了較強(qiáng)的免疫力，在后期的繁殖過程中將自身的抗體傳給雛鵝，從而使雛鵝存在自然被動(dòng)免疫力。小鵝瘟給養(yǎng)鵝業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失，因此受到科研工作者的廣泛重視。

目前關(guān)于GPV的免疫學(xué)方面的研究熱點(diǎn)主要包括活疫苗、滅活疫苗及基因工程疫苗的研制、研制與開發(fā)單克隆抗體以及抗原表位相關(guān)方面的研究。近些年分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的取得了快速進(jìn)步，單克隆抗體技術(shù)也得到較好的發(fā)展，已經(jīng)在遺傳學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域受到廣泛應(yīng)用[1-2]。弱毒疫苗株是目前較為常用的小鵝瘟疫苗，對(duì)成年鵝和雛鵝并不會(huì)產(chǎn)生致病性，但是其保護(hù)力較弱、毒力返強(qiáng)、外源病原難以控制以及生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)。基因疫苗為一類帶有外源抗原基因的真核重組質(zhì)粒，在動(dòng)物體內(nèi)的宿主細(xì)胞中完成轉(zhuǎn)錄和翻譯過程后，能夠表達(dá)出相應(yīng)的抗原蛋白，誘導(dǎo)出具有特異性的體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫應(yīng)答，從而達(dá)到預(yù)防和控制疾病的目的[3]。由于大部分天然抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)并不能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)防感染或預(yù)防發(fā)病的目的，在表位水平上這就需要做出選擇從而改善蛋白質(zhì)抗原的保護(hù)性，進(jìn)而可以得到更理想的疫苗分子[4]。因此，鵝細(xì)小病毒免疫學(xué)是研究鵝細(xì)小病毒工作的重要組成部分，為更好的防范、控制小鵝瘟，切實(shí)為養(yǎng)殖企業(yè)帶來安全保障具有非常重要意義。

1　鵝細(xì)小病毒病原學(xué)特征

GPV呈現(xiàn)六角形或者圓形的外觀，不存在囊膜，同時(shí)也不帶有脂類以及糖類，直徑大約為20 nm～22 nm，在掃描電鏡下GPV以晶格排列，存在著完整的病毒粒子以及病毒空殼。GPV含有相等數(shù)目的正、負(fù)鏈DNA的病毒粒子，在提取核酸過程中，正、負(fù)極性鏈?zhǔn)秩菀装l(fā)生退火的現(xiàn)象形成互補(bǔ)的雙鏈DNA。GPV的基因組有LORF以及RORF兩個(gè)開放閱讀框架，2個(gè)開放閱讀框架之間存在一個(gè)18個(gè)堿基的片段，LORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2），RORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3）。VP2、VP3結(jié)構(gòu)蛋白是其主要免疫功能區(qū)，VP3結(jié)構(gòu)蛋白是GPV的主要衣殼蛋白，VP3含有GPV主要抗原決定簇成分，因此VP3基因編碼的VP3蛋白在小鵝瘟免疫防治和診斷中起重要作用，是研究基因工程疫苗的首選蛋白[5]。

2　鵝細(xì)小病毒免疫學(xué)研究進(jìn)展

2.1弱毒疫苗及基因疫苗的研究目前弱毒疫苗和滅活疫苗是主要用于小鵝瘟預(yù)防的疫苗，弱毒疫苗通過母源抗體使雛鵝獲得被動(dòng)免疫的能力，可以誘導(dǎo)雛鵝產(chǎn)生持久的體液免疫，但是誘導(dǎo)雛鵝產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答能力較弱。胡世君等用鴨胚尿囊液獲得的GPV病毒株，通過甲醛進(jìn)行滅活，以此為抗原，加入礦物油佐劑，得到了油乳劑滅活苗，并且進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和臨床檢測(cè)，得到了很好的免疫保護(hù)效果[6]。潘玉民等利用白油作為佐劑，病原為當(dāng)?shù)胤蛛x到的小鵝瘟病毒，制備滅活疫苗，在臨床中應(yīng)用于種鵝，在產(chǎn)蛋前20 d開始肌肉注射，每只1 mL，雛鵝的接種量為0.5 mL/只，接種該疫苗后，攻毒保護(hù)率為100%，因此證明該疫苗具有良好的保護(hù)效果和免疫原性[7]。陳伯倫等研究利用鴨胚進(jìn)行弱化小鵝瘟病毒的毒力，而得到的弱毒疫苗，進(jìn)行免疫種鵝，有95%的雛鵝具有抵抗小鵝瘟的能力，270～300 d內(nèi)所產(chǎn)的蛋所孵出的雛鵝的免疫保護(hù)率為80%，結(jié)果說明母鵝所產(chǎn)出的雛鵝具有很好的免疫力[8]。

李琳選用自己分離的具有良好的免疫原性GPV JLDA株濃縮后，按照一定的配比加入白油、乳化劑等作為佐劑，成功地研制了鵝細(xì)小油乳劑滅活疫苗，GPV最小免疫劑量為0.25 mL/羽，在4℃的條件下油苗可以完好保存2年，室溫的條件下可以保存1個(gè)月的時(shí)間，物理性狀和免疫原性并沒有發(fā)生改變，符合油乳劑疫苗的標(biāo)準(zhǔn)，用4倍量進(jìn)行免疫，試驗(yàn)鵝無不良反應(yīng)[9]。韓新峰將鵝白介素-2和VP3基因進(jìn)行串聯(lián)融合表達(dá)，還嵌入了一段CpG免疫刺激序列，將獲得的3種基因疫苗免疫種鵝，母鵝所產(chǎn)蛋的卵黃抗體和中和抗體規(guī)律與所孵化的雛鵝攻毒保護(hù)效果呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，其中以pcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫母鵝所孵出的后代雛鵝的攻毒保護(hù)率最高[3]。

2.2單克隆抗體的研制與開發(fā)具有高度敏感性以及特異性等的單克隆抗體，在動(dòng)物疫病的診斷以及治療過程中有著不可替代的作用，在對(duì)GPV的相關(guān)研究中，我國許多科研工作者對(duì)抗小鵝瘟病毒的抗體進(jìn)行了一定的探究。李新華以GPV強(qiáng)毒和弱毒為免疫原研制抗體，成功得到2株抗GPV弱毒的單抗和9株抗GPV強(qiáng)毒的單抗，同時(shí)還對(duì)抗小鵝瘟病毒中和性單克隆抗體進(jìn)行了研制[10]；鄭義民以GPV強(qiáng)毒為免疫原制備了6株單抗，對(duì)GPV具有很好的特異性，不能與鴨肝炎病毒等反應(yīng)[11]；李長瑜利用病毒抗原對(duì)6～8周齡小鼠進(jìn)行4次免疫，然后采用免疫效價(jià)較高的小鼠脾細(xì)胞與SP/20骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，成功地篩選出來了8株能很好分泌抗GPV單抗，其陽性率大約為10.26%[12]。王娟將純化得到的GPV液作為制備單克隆抗體的免疫原，對(duì)6周齡雌性小鼠進(jìn)行免疫試驗(yàn)，成功得到3株能穩(wěn)定分泌抗GPV的單抗的雜交瘤細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此單克隆抗體能與GPV發(fā)生特異性反應(yīng)，而與DHV、NDV、DPV并不會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)[13]。

VP2和VP3是GPV的主要免疫功能區(qū)，與VP3存在相同的抗原決定簇，是制備基因工程疫苗的重要的基因。侯秋蓮對(duì)GPV中國分離株HG5/82毒株的VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增、構(gòu)建重組質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化后獲得融合蛋白，將純化的蛋白產(chǎn)物經(jīng)3次肌肉注射新西蘭白兔，制備結(jié)構(gòu)蛋白抗體，采用Western Blot方法對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白反應(yīng)原性分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，所得融合蛋白擁有很好的反應(yīng)原性[14]。杜秋明利用濃縮的GPV免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，成功地獲得一株抗GPV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，試驗(yàn)結(jié)果表明，雜交瘤細(xì)胞株能夠特異性的識(shí)別GPV尿囊毒和GPV-VP3蛋白，同時(shí)而與GST蛋白、GPMV、DHV、DPV無交叉反應(yīng)，證明雜交瘤細(xì)胞株McAb有較好的特異性，雜交瘤細(xì)胞株McAb識(shí)別的表位可能位于GPV VP3蛋白的保守區(qū)域，雜交瘤細(xì)胞株McAb能與GPV-VP3蛋白反應(yīng)[15]。鹿鐘文利用GPV SYG61作為抗原3次免疫小鼠，再取其脾細(xì)胞與SP2/ 0細(xì)胞進(jìn)行融合，成功地獲得了2株抗GPV的單克隆抗體，通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)一步證明所得到的單抗腹水皆可以與小鵝瘟抗原產(chǎn)生明顯的沉淀線，同時(shí)都能夠與GPV VP3蛋白發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生特異性的亮綠色熒光[16]。

GPV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是GPV的主要非結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)GPV-NS1抗原表位進(jìn)行研究，不僅有助于我們掌握其抗原結(jié)構(gòu)的功能，在小鵝瘟早期的防治、診斷和病毒的抗原位點(diǎn)功能研究中具有重要的意義。仇錚利用重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GPV-NS1以及純化重組蛋白GPV-NS1為抗原，對(duì)4-6周齡的小鼠進(jìn)行分組免疫試驗(yàn)，然后將其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，其中的4株單克隆抗體能夠與pcDNA3.1-GPV-NS1產(chǎn)生強(qiáng)熒光的信號(hào)，表明單克隆抗體存在著特異性，同時(shí)Western Blot試驗(yàn)結(jié)果表明，所獲得的單克隆抗體能夠與重組NS1非結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)[17]。

2.3抗原表位的研究研究GPV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的抗原表位相關(guān)內(nèi)容，一方面有利于發(fā)現(xiàn)其抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，另一方面對(duì)GPV快速且準(zhǔn)確的診斷以及研制并開發(fā)安全、高效的基因工程表位疫苗等具有十分重要的意義。李俚利用GPV-VP1重組融合蛋白與不同雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體進(jìn)行免疫試驗(yàn)反應(yīng)，Western Blot試驗(yàn)結(jié)果表明，單克隆抗體4B11、5G6、5C11的識(shí)別表位存在于GPV-VP1的92aa～123aa內(nèi)；3A8識(shí)別的表位存在于111aa～136aa內(nèi)；3G4識(shí)別的表位限定在111aa～145aa內(nèi)[18]。郭鷺利用Ni-NTA親和層析純化后的GPV VP3重組蛋白作為免疫原，免疫電鏡和間接免疫熒光證明4株單抗能夠與GPV全病毒結(jié)合。通過Western Blot定位出兩個(gè)抗原表位為430aa～435aa和643aa～647aa[19]。王娟對(duì)抗GPV單克隆抗體的抗原表位進(jìn)行了分析，根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝細(xì)小病病毒株全基因序列，采用分段PCR方法對(duì)GPVVP3基因進(jìn)行了擴(kuò)增，然后成功獲得表達(dá)重組質(zhì)粒；將篩選到的4個(gè)陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，用間接免疫熒光進(jìn)行檢測(cè)顯示，在VP3基因的135aa～332aa和322aa～535aa處可以看到在COS-1細(xì)胞表而可見特異性熒光，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了單克隆抗體的特異性，確定在322aa～332aa處為3E8株單抗的抗原表位部分[2]。于天飛設(shè)計(jì)了覆蓋NS1蛋白C末端453aa～627aa的7個(gè)長約30個(gè)氨基酸殘基的重疊短肽，然后進(jìn)行融合表達(dá)。結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白NSb（485aa～514aa）、NSc（498aa～532aa）、NSd （523aa～556aa）、NSe（543aa～573aa）、NSf（564 aa～598aa）和NSg（599aa～627aa）能夠被GPV免疫的鵝血清識(shí)別[20]。仇錚結(jié)合單克隆抗體（MAb）技術(shù)對(duì)NS1抗原表位進(jìn)行了鑒定，其中有3株MAb識(shí)別的抗原表位均位于485 aa～542 aa，表明485 aa～542 aa這一抗原表位區(qū)的抗原性最強(qiáng)[17]。黎明等采用生物學(xué)軟件對(duì)MDPV病毒蛋白的抗原表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并與GPV病毒蛋白抗原表位進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，相同的表位優(yōu)勢(shì)區(qū)域能夠產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可能存在交叉反應(yīng)性的區(qū)段為321aa～325aa、426aa～430aa、540aa～544aa以及685aa～691aa[21]。李書光通過軟件優(yōu)化分析預(yù)測(cè)GPV結(jié)構(gòu)蛋白VP3段的抗原表位富集區(qū)，并設(shè)計(jì)引物，原核可溶性表達(dá)VP3的抗原表位富集區(qū)蛋白，免疫制備的抗血清中和效價(jià)能夠達(dá)到-2.608，以可溶性形式成功表達(dá)了GPV結(jié)構(gòu)蛋白VP3優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)，且該蛋白作為免疫原具有很好的產(chǎn)生中和抗體的能力[5]。

3　展望

由于GPV本病傳播迅速、致死率高，開展GPV免疫相關(guān)方面的研究顯得尤為重要，常規(guī)疫苗對(duì)防制小鵝瘟起到了一定作用，但其自身存在不可避免的缺點(diǎn)，雖然如今開展了眾多關(guān)于GPV保護(hù)性基因的克隆和基因工程載體疫苗的構(gòu)建，GPV核苷酸序列測(cè)定已為構(gòu)建病毒載體和研制基因工程疫苗打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，雖然大多局限于體外的研究，迄今為止GPV的疫苗研制、鑒別診斷、分子流行病學(xué)等，有待于進(jìn)一步研究；研究以及制備抗GPV單克隆抗體，并對(duì)抗原表位進(jìn)行研究，為建立以表位為基礎(chǔ)的抗原抗體診斷方法奠定一定基礎(chǔ)；由于GPV結(jié)構(gòu)蛋白具有一定特殊性，鑒定的抗原表位可以同時(shí)作為VP1、VP2、VP3結(jié)構(gòu)蛋白的共有表位，若為中和表位則可以能夠在重組診斷抗原和疫苗研制方面表現(xiàn)出更大的意義，這還需要付出更多的研究工作來進(jìn)一步驗(yàn)證。

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S852.65+9.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0529-6005（2016）07-0064-03

2015-12-07

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130522086JH）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20112223110002）；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（201231）；吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（2015209）

杜翔宇（1989-），女，碩士生，從事分子病原微生物與分子免疫學(xué)研究，E-mail：dxy1209@163.com

董浩，E-mail：donghao_jlau@163.com