日糧中添加中鏈甘油三酯和半胱胺酸鹽對(duì)斷奶仔豬和生長(zhǎng)育肥豬內(nèi)源性生長(zhǎng)軸的影響

孟春春（譯）

（北京百邁客生物科技有限公司，北京 101300）

日糧中添加中鏈甘油三酯和半胱胺酸鹽對(duì)斷奶仔豬和生長(zhǎng)育肥豬內(nèi)源性生長(zhǎng)軸的影響

孟春春（譯）

（北京百邁客生物科技有限公司，北京 101300）

該文通過(guò)3個(gè)試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)總體假設(shè)，即在仔豬和生長(zhǎng)豬的日糧中添加中鏈甘油三酯（MCT）和半胱胺酸鹽（CSH）將會(huì)刺激其內(nèi)源性生長(zhǎng)軸，從而改善其生長(zhǎng)和性能。試驗(yàn)1結(jié)果顯示：日糧中添加MCT增加了斷奶仔豬血漿中生長(zhǎng)激素（GH）（P＜0.05）和生長(zhǎng)激素促分泌素（Ghrelin）的濃度（P＜0.05）。此外，與對(duì)照組相比，MCT處理組減少了仔豬腹瀉（P＜0.05），維持了其小腸絨毛高度（P＜0.05）且仔豬日增重穩(wěn)定（P＜0.05）。試驗(yàn)2結(jié)果顯示，MCT的添加增加了生長(zhǎng)激素促分泌素（Ghrelin）（P＜0.001）、GH（P＜0.01）和胰島素（P＜0.05）的濃度，且呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性；而日糧中添加MCT對(duì)豬只的日增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化率無(wú)影響。試驗(yàn)3結(jié)果顯示，飼喂3周后，與對(duì)照組和CSH處理組相比，MCT處理組的豬只血漿Ghrelin濃度明顯升高（P＜0.05），而血漿GH濃度和體重則不受任何處理的影響。結(jié)論：試驗(yàn)1的結(jié)果表明日糧中添加MCT，可能是通過(guò)刺激生長(zhǎng)激素內(nèi)分泌途徑將斷奶相關(guān)病癥（例如生長(zhǎng)遲緩和腹瀉）降到最低。在試驗(yàn)2和試驗(yàn)3中，盡管MCT和CSH的添加對(duì)豬只的增重或飼料轉(zhuǎn)化率沒(méi)有影響，但是增加了其生長(zhǎng)軸的內(nèi)分泌組分。

Ghrelin；生長(zhǎng)；豬；促生長(zhǎng)激素細(xì)胞

1 研究背景

生長(zhǎng)激素是一種由垂體前葉促生長(zhǎng)激素細(xì)胞分泌并受兩種下丘腦神經(jīng)激素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，這兩種下丘腦神經(jīng)激素特異性作用以刺激（通過(guò)生長(zhǎng)激素釋放激素，GHRH）或抑制（通過(guò)生長(zhǎng)抑素）生長(zhǎng)激素GH的釋放。GH的作用是通過(guò)增強(qiáng)肌細(xì)胞利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，同時(shí)協(xié)調(diào)其他生理過(guò)程和組織來(lái)促進(jìn)瘦肉的生長(zhǎng)。已有研究表明日糧中添加巰基化合物半胱胺酸鹽（CSH），可增加大鼠、綿羊和魚(yú)中的GH分泌；在日糧中添加30 mg/kg和50 mg/kg的CSH可顯著提高育肥豬的日增重，但對(duì)血漿GH濃度無(wú)影響；在日糧中添加70 mg/kg的CSH可提高肥育母豬的日增重，但在本研究中未檢測(cè)GH水平。

生長(zhǎng)激素促分泌素（Ghrelin），最初是從大鼠胃中分離出的一種GH釋放肽，刺激GH從垂體前葉釋放。已有研究表明在哺乳動(dòng)物中Ghrelin具有多種生理功能，包括促進(jìn)GH釋放、食欲刺激、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡抑制，以及調(diào)節(jié)肌肉中脂類(lèi)代謝和組織脂肪的分布。Salfen等人發(fā)現(xiàn)給斷奶仔豬灌注5 d的Ghrelin，可促進(jìn)GH分泌進(jìn)而引起體重的增加。Ghrelin的主要活性形式是一種由28個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽，在此肽的第3個(gè)氨基酸（絲氨酸）上含有辛酸（C8:0）脂肪酸。翻譯后C8修飾對(duì)于Ghrelin的生物活性是必不可少的，允許與其受體結(jié)合，這導(dǎo)致GH在垂體水平的釋放。據(jù)報(bào)道，在椰子中提取的中鏈甘油三酯（MCT）具有高濃度辛酸，可直接用于大鼠中Ghrelin的生物活化。然而，目前對(duì)豬的研究中尚沒(méi)有涉及在日糧中添加MCT對(duì)生長(zhǎng)激素生長(zhǎng)反應(yīng)的影響以及Ghrelin生物活性水平在循環(huán)中受到的影響。

本研究共進(jìn)行了3個(gè)試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)總體假設(shè)，即在仔豬和生長(zhǎng)豬的日糧中添加MCT和CSH將會(huì)刺激其內(nèi)源性生長(zhǎng)軸，從而改善其生長(zhǎng)和性能。試驗(yàn)1旨在探討斷奶仔豬的日糧中添加MCT是否會(huì)增加循環(huán)中Ghrelin的生物活性，并且具有生物活性的Ghrelin的增加是否將促進(jìn)GH釋放。試驗(yàn)2的目的是確定在生長(zhǎng)育肥豬的飼料中MCT的最佳添加量，以研究生長(zhǎng)激素生長(zhǎng)反應(yīng)。在試驗(yàn)3中，比較了日糧中MCT與CSH的添加對(duì)生長(zhǎng)育肥豬的影響。

2 研究方法

2.1 試驗(yàn)1

選取24頭21日齡大白豬與長(zhǎng)白豬的雜交后代，公母各半，每頭豬的平均體重在（5.12±0.24）kg范圍之間，并將這24頭豬分配到2個(gè)1.5 m×1.5 m室內(nèi)豬舍，保持恒溫28 ℃。將這些豬在恒溫豬舍中飼養(yǎng)5 d以適應(yīng)斷奶后飼喂的乳豬料。每個(gè)恒溫豬舍中都有一個(gè)奶頭式飲水器和兩個(gè)飲奶器。

在這5 d中，按照說(shuō)明書(shū)向豬提供Pigiplus 商業(yè)合成的乳豬料，并向每8 L Pigiplus 中添加50 g干牛初乳和50 mL的益生菌。Pigiplus 含有約14%的脂肪、22%的蛋白質(zhì)、43%的乳糖和0.2%的纖維。每間隔2 h清洗一次進(jìn)料器并加入新鮮牛奶。5 d后，選擇16頭（8頭公豬和8頭母豬）健康豬只用于試驗(yàn)。將這些豬飼養(yǎng)于含有乳頭飲水器和飲奶器的1.5 m×0.75 m豬舍中，然后將豬隨機(jī)分配到2個(gè)處理組中，并確保兩組的公母數(shù)量相同，有相近的血統(tǒng)關(guān)系和體重。2個(gè)處理組分別是對(duì)照組和MCT組，對(duì)照組飼喂乳汁替代品日糧（n=8；Pigiplus ），MCT組飼喂添加了5%MCT（MCT油）的乳汁替代日糧（n=8）。MCT油脂由含有辛酸（C8）（65%～75%），癸酸（C10）（25%～35%）和己酸（C6）（＜1%）的椰子油精制而成。為保證日糧所含的能量相同，在對(duì)照日糧中添加4.7%（v/v）菜籽油。持續(xù)飼喂5 d，每天測(cè)量活重和飼料剩余量。在試驗(yàn)期間，由相同的工作人員每天09:00和15:00對(duì)豬進(jìn)行觀察，記錄是否出現(xiàn)腹瀉的臨床癥狀。如果在每天的任一觀察時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)有新鮮稀糞黏附在豬的會(huì)陰處，或者在排便期間觀察到稀糞，則該豬被記錄為在當(dāng)天具有腹瀉癥狀。

在試驗(yàn)第5天，通過(guò)上腔靜脈的靜脈穿刺對(duì)試驗(yàn)豬只進(jìn)行采血，每頭豬采1 mL血樣。將血液收集到有EDTA抗凝真空采血管中，立即離心，將血漿用1%（v/v）HCl酸化以防止Ghrelin降解，并且將所有樣品立即儲(chǔ)存于-20 ℃條件下。

在試驗(yàn)第6天利用達(dá)到致死劑量的Valabarb （戊巴比妥鈉[鎮(zhèn)靜催眠藥]）對(duì)豬進(jìn)行安樂(lè)死，并從小腸（十二指腸、空腸和回腸）的各個(gè)區(qū)段收集組織樣品。將這些組織在Bouin溶液（該固定液為組織學(xué)、病理學(xué)常用固定劑）中固定6 h，然后加工成蠟塊，并使用切片機(jī)制作5 μm切片用于組織學(xué)觀察。每個(gè)組織以200 μm間隔取得6個(gè)切片，并用蘇木精和伊紅染色。根據(jù)Pluske等人描述的方法，在H＆E染色的載玻片上進(jìn)行絨毛高度和隱窩深度的測(cè)量。對(duì)于每個(gè)組織切片，在10個(gè)隨機(jī)選擇的視野中進(jìn)行絨毛高度和隱窩深度的截面測(cè)量，此方法已被證明可以穩(wěn)定計(jì)算結(jié)果的平均值和方差。

2.2 試驗(yàn)2

選擇60頭14～22周齡的大白豬（作為父本）與長(zhǎng)白豬的雜交后代，分為4組，每組15頭，并分別在單獨(dú)的豬舍中飼喂，對(duì)照組飼喂標(biāo)準(zhǔn)商用飼料，其他3組分別以1%、3%和6%的比例在飼料中添加MCT（MCT油脂）。使用菜籽油調(diào)節(jié)日糧中的能量水平，并添加小麥和豆粕以保證足夠的能量、蛋白質(zhì)和賴(lài)氨酸，賴(lài)氨酸已被證明對(duì)于促進(jìn)GH增加所必需的。每天測(cè)量活重和飼料剩余量。在飼喂MCT的第21天，每組選擇生長(zhǎng)速率接近于組平均值的豬6頭，通過(guò)外耳側(cè)或耳蝠處耳靜脈插入臨時(shí)導(dǎo)管進(jìn)行采血（耳靜脈插管技術(shù)與Zanella和Mendl采用的方法類(lèi)似），每次取完血樣后都用約1 mL含有5 IU/mL肝素溶液的無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行沖洗，以避免兩次采血間的污染。在插管后的第2天，以15 min間隔連續(xù)采取4 h血樣于EDTA管中，每次取1 mL。每次采血將最初的2 mL血液棄掉，以避免所采的1 mL血樣被生理鹽水稀釋。每次采血后立即離心，取200 μL血漿并將每只動(dòng)物的血漿混合在一起，考慮到GH的偶發(fā)性分泌，用1%（v/v）HCl酸化并立即儲(chǔ)存于-20 ℃條件下。將收集的樣品用于后續(xù)的激素分析。

2.3 試驗(yàn)3

該試驗(yàn)使用62頭大白豬和長(zhǎng)白豬的雜交母豬，將其在產(chǎn)后大約10周齡時(shí)置于單獨(dú)的豬舍中用商用飼料進(jìn)行飼養(yǎng)以使其適應(yīng)生長(zhǎng)，直至16周齡時(shí)將其用于試驗(yàn)。將豬稱(chēng)重，做耳標(biāo)，并隨機(jī)分配到3個(gè)處理組中：對(duì)照組（普通商用飼料飼喂）、日糧中含有6%MCT組（基于試驗(yàn)2的發(fā)現(xiàn)）和日糧中添加CSH（半胱胺酸鹽）組，每個(gè)處理組21頭豬（對(duì)照組20頭）。將CSH以70 mg/kg的劑量摻入飼料中。每周記錄活重，每天記錄飼料剩余量。在產(chǎn)后19周，從每組選擇生長(zhǎng)速率接近于組平均值的豬7頭采血樣。耳靜脈插管和血液取樣方法如試驗(yàn)2所述。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，一旦豬達(dá)到適當(dāng)?shù)耐涝左w重（95±5）kg，將豬送到商業(yè)屠宰場(chǎng)進(jìn)行屠宰，并記錄P2點(diǎn)背膘厚、胴體重和屠宰率。使用Hennessy分級(jí)探針4測(cè)量P2位點(diǎn)（最后一根肋骨處距背中線(xiàn)6.5 cm）處的背膘厚。

2.4 激素分析

從分析試驗(yàn)1、2和3組收集血漿中的?；?Ghrelin、GH、IGF-1和胰島素。使用ELISA試劑盒測(cè)定?；?Ghrelin，該試劑盒測(cè)定的靈敏度為25 pg/mL，分別具有3.8%（CV）和7.5%（CV）的批內(nèi)精確度和批間精確度。使用ELISA試劑盒測(cè)定GH。該測(cè)定的靈敏度為0.54 ng/mL，其中批內(nèi)和批間的精確度分別為4.1%（CV）和9.1%（CV）。使用ELISA試劑盒測(cè)定IGF-1，靈敏度的測(cè)定為26 ng/mL，具有批內(nèi)和批間精度分別為3.5%（CV）和8.1%（CV）。胰島素使用ELISA試劑盒。測(cè)定的靈敏度為0.062 ng/mL，其中批內(nèi)和批間精密度分別為3.5%（CV）和6.9%（CV）。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，將處理和時(shí)間作為固定效應(yīng)，動(dòng)物（ID，同胞關(guān)系和性別）作為隨機(jī)效應(yīng)。使用事后Fisher's最小顯著極差法來(lái)檢驗(yàn)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理之間的特異性差異。使用卡方分析檢驗(yàn)腹瀉發(fā)生率的差異。

3 結(jié)果

3.1 試驗(yàn)1

在5 d的試驗(yàn)中，有顯著的時(shí)間效應(yīng)（P＜0.01），但是處理對(duì)于飼料攝入量或者處理和時(shí)間的相互作用對(duì)于飼料攝入量均無(wú)顯著性影響。時(shí)間或處理對(duì)于平均日增重（ADG）和飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）均沒(méi)有顯著影響，但是處理和時(shí)間有顯著的相互作用（P ＜0.05）。具體來(lái)說(shuō)，相對(duì)于對(duì)照組，MCT組在第2天（343 g/d相對(duì)于246 g/d）和第3天（394 g/d相對(duì)于235 g/d）的ADG顯著增加（P＜0.05）。在第5天，與對(duì)照組（240 g/d相對(duì)于160 g/d）相比，MCT組的ADG顯著增加（P＜0.05），對(duì)照組的ADG在試驗(yàn)的最后2 d下降了近60%。在試驗(yàn)的第3天和第5天，MCT組的FCR分別比對(duì)照組約增加45%（P＜0.05）和降低40%（P＜0.01）。此外，觀察到對(duì)照組8頭豬中的4頭在試驗(yàn)的最后2 d內(nèi)具有明顯的腹瀉，而在試驗(yàn)過(guò)程中MCT處理的豬并未出現(xiàn)腹瀉（P＜0.05）。

在試驗(yàn)之前，測(cè)量的任何血漿激素在仔豬組之間沒(méi)有差異?？傮w而言，時(shí)間或處理對(duì)任何激素沒(méi)有影響，但是處理和時(shí)間的相互作用對(duì)Ghrelin（P＜0.05）、GH（P ＜0.05）和胰島素（P＜0.001）均有顯著性影響。具體來(lái)說(shuō)，在處理的第5天，與對(duì)照組相比，MCT處理組中血漿Ghrelin濃度增加了16%（P ＜0.05）。血漿GH濃度在第5天沒(méi)有差異，但是在第0天和第5天之間GH濃度的變化存在顯著性差異（P＜0.05），在對(duì)照組中降低了34%，而在MCT組中增加了13%。在處理的第5天，MCT組的血漿胰島素濃度降低4倍（P＜0.001），但血漿IGF-1濃度沒(méi)有差異。腸道形態(tài)的組織學(xué)分析表明，與MCT處理組相比，對(duì)照豬中小腸十二指腸和回腸區(qū)的絨毛高度降低了約25%。

3.2 試驗(yàn)2

與整個(gè)試驗(yàn)期間的對(duì)照組相比，日增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化率不受在日糧中添加3個(gè)水平（1%、3%和6%）的MCT中任一個(gè)的影響。在第17周，采集的合并血液樣品的血漿激素分析表明，MCT添加劑以劑量依賴(lài)性方式增加Ghrelin（P＜0.001）、GH（P＜0.01） 和胰島素（P＜0.05）的濃度。相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，6%MCT添加量可導(dǎo)致Ghrelin濃度增加48%（P＜0.001），GH濃度增加130%（P＜0.05），胰島素濃度增加33%（P＜0.05），而MCT添加劑對(duì)循環(huán)IGF-1濃度沒(méi)有影響。

3.3 試驗(yàn)3

與整個(gè)試驗(yàn)期間的對(duì)照組相比，日增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化率不受MCT或CSH添加劑的影響。達(dá)到屠宰體重（95±5） kg所需天數(shù)、胴體重和屠宰率在處理組之間均沒(méi)有顯著性差異。與對(duì)照組相比，MCT和CSH處理組的豬在P2點(diǎn)背膘厚有顯著差異，MCT飼養(yǎng)的豬P2點(diǎn)背膘厚降低了19%（P＜0.01），CSH豬降低了14%（P＜0.01）。處理組豬之間的血漿Ghrelin平均濃度存在總體差異（P＜0.05）。具體來(lái)說(shuō)，飼喂MCT豬與對(duì)照豬相比Ghrelin濃度增加26%（P＜0.05），且與CSH豬相比Ghrelin濃度增加46%（P＜0.01）。但處理組之間的GH、IGF-1或胰島素濃度沒(méi)有差異。

4 討論

4.1 試驗(yàn)1

本研究發(fā)現(xiàn)，雖然添加5 d的5% MCT油脂對(duì)增加豬只采食量或促進(jìn)其生長(zhǎng)沒(méi)有影響，但似乎抑制了對(duì)照豬中觀察到的腹瀉相關(guān)的生長(zhǎng)率下降。還有證據(jù)表明，日糧添加MCT可用于增加具有生物活性的Ghrelin血漿濃度。本研究結(jié)果與Nishi等人的研究結(jié)果是一致的，他們?cè)诖笫笾凶C明了日糧中添加5%MCT油脂可增加酰化Ghrelin的血漿濃度，而不改變總Ghrelin水平。MCT試驗(yàn)組日糧中所含的辛酸可以附著于去?；腉hrelin（無(wú)活性）肽的第3個(gè)氨基酸（絲氨酸），這種修飾允許Ghrelin肽與其受體結(jié)合，因此是必需的生物過(guò)程。Salfen等人發(fā)現(xiàn)飼喂5 d的Ghrelin可促進(jìn)豬只增重并伴隨斷奶仔豬GH分泌增加。雖然本研究結(jié)果表明循環(huán)GH濃度受到了影響，但是這與Salfen等人的發(fā)現(xiàn)是相悖的，這可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)飼喂MCT和輸注MCT兩種方式所導(dǎo)致的Ghrelin增加量不同，前者導(dǎo)致生物活性Ghrelin水平增加約16%，而后者導(dǎo)致總Ghrelin水平增加了25倍。雖然這兩個(gè)研究測(cè)量不同形式的Ghrelin分子，但反應(yīng)的幅度差異值得注意。增加日糧中MCT油脂的添加量以獲得更高的生物活性Ghrelin水平可能是有問(wèn)題的，因?yàn)楦哂椭靠赡軐?dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不平衡的飲食。此外，對(duì)新生仔豬的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MCT-油脂的過(guò)量添加可能導(dǎo)致麻醉效應(yīng)，這可能導(dǎo)致仔豬活力下降，從而增加其死亡率。

4.2 試驗(yàn)2

本研究表明，相比1%和3%的添加比例來(lái)說(shuō)，生長(zhǎng)豬或育肥豬日糧中添加6% MCT對(duì)于增加具有生物活性的Ghrelin和循環(huán)GH濃度是最佳的添加比例。然而在本研究中對(duì)生長(zhǎng)性能沒(méi)有影響，一個(gè)可能的原因就是6% MCT日糧添加處理（約14 ng/mL，與對(duì)照相比增加2倍）引起的GH刺激水平不足以顯著性影響豬的生長(zhǎng)。Hansen等人發(fā)現(xiàn)，給生長(zhǎng)豬每日注射pST（豬生長(zhǎng)激素）可促使內(nèi)源性GH濃度提高到約14 ng/mL，這對(duì)肌蛋白的沉積沒(méi)有影響。而Klindt等人發(fā)現(xiàn)，pST埋植劑可促使閹割雄性豬的內(nèi)源性GH濃度提高到約30 ng/mL，從而導(dǎo)致平均日增重增加22%。事實(shí)上，在本研究中缺乏添加MCT對(duì)IGF-1水平的作用也表明GH刺激僅僅是適度的。

4.3 試驗(yàn)3

在生長(zhǎng)豬或育肥豬的日糧中添加6% MCT或CSH可以增加內(nèi)源性GH水平、提高體重增加速率和飼料轉(zhuǎn)化率的假說(shuō)并未得到證實(shí)。日糧中添加MCT或CSH對(duì)血漿GH濃度、平均日增重或采食量沒(méi)有影響。然而，MCT確實(shí)增加了循環(huán)中的活性Ghrelin水平，并且MCT和CSH都降低了P2點(diǎn)背膘厚。對(duì)生長(zhǎng)系統(tǒng)影響甚微的原因尚不清楚，然而從Etherton等人的研究中可以得到，pST注射后血漿GH濃度增加至約25 ng/ mL，從而引起體重增加，缺乏GH刺激可減弱對(duì)體重增加和采食量的影響。添加MCT和CSH的動(dòng)物缺乏GH反應(yīng)的原因可能包括：1）MCT對(duì)生物活性Ghrelin的刺激不足，以及CSH對(duì)生長(zhǎng)抑素的抑制不足，導(dǎo)致GH水平升高；2）動(dòng)物數(shù)量不足以獲得GH或生長(zhǎng)刺激的適度增加；3）MCT和CSH處理可能最初增加了GH水平，但是這種效應(yīng)在血液采樣當(dāng)天沒(méi)有持續(xù)。

5 結(jié)論

試驗(yàn)1中的數(shù)據(jù)顯示，在日糧中添加MCT作為一種為機(jī)體提供活化Ghrelin的方式，可能是導(dǎo)致絨毛高度增加的機(jī)制。雖然試驗(yàn)期太短，無(wú)法檢測(cè)MCT對(duì)生產(chǎn)的長(zhǎng)期影響，但有一些建議認(rèn)為MCT減少了哺乳仔豬的腹瀉，并減少了斷奶后GH水平的下降。

在試驗(yàn)2和試驗(yàn)3中，除了刺激循環(huán)生物活性Ghrelin的濃度之外，MCT對(duì)生長(zhǎng)性能或生長(zhǎng)軸的刺激沒(méi)有影響。CSH對(duì)生長(zhǎng)性能或刺激生長(zhǎng)軸也沒(méi)有任何影響，這表明該試驗(yàn)設(shè)計(jì)不足以獲得GH水平和體重增加的適度變化，或者M(jìn)CT和CSH對(duì)背膘減少的影響是獨(dú)立的，與生長(zhǎng)激素的作用無(wú)關(guān)。

（原文作者：David W. Miller1?,Zoe Prosser1,Edward Y. W. Chee1,Christian F. Hansen2,Frank R. Dunshea3,Bruce P. Mullan4and John R. Pluske1）

（原文鏈接：http://jasbsci.biomedcentral. com/articles/10.1186/s40104-016-0121-9）

2016-11-01）