MicroRNA作為阿爾茨海默病標(biāo)志物的研究進(jìn)展

楊婷婷 劉辰庚 王培昌

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053)

?

MicroRNA作為阿爾茨海默病標(biāo)志物的研究進(jìn)展

楊婷婷 劉辰庚 王培昌

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053)

阿爾茨海默??；腦脊液miRNA；血清miRNA；AD標(biāo)志物

阿爾茨海默病(AD)是一種慢性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，早期癥狀表現(xiàn)為短期記憶喪失、失語(yǔ)、方向感下降，隨著病情的發(fā)展會(huì)出現(xiàn)各種神經(jīng)精神癥狀，行為異常，生活不能自理，直至死亡〔1,2〕。隨著社會(huì)發(fā)展,老齡化速度的加快,AD的患病率也逐漸上升〔3〕。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界65歲以上人口患有AD為5 000多萬,并且估算2020年將增加50%〔3,4〕。我國(guó)AD人數(shù)達(dá)500萬，數(shù)據(jù)顯示，60歲人群中患病率為5%，80歲為20%〔5〕。目前AD已經(jīng)成為威脅老年人健康的第四大殺手，其死亡率僅低于心腦血管疾病、腫瘤和腦卒中，嚴(yán)重危害老年人的身體健康和生活質(zhì)量〔6〕。由于AD發(fā)病時(shí)間較晚，并且沒有特異性指標(biāo)，早期很容易被忽略，很多患者被確診時(shí)已發(fā)展至癡呆階段。而患者一旦進(jìn)入癡呆階段，將面臨無有效治療方法可用的尷尬。故力求在癡呆前階段對(duì)AD進(jìn)行診斷和預(yù)警并進(jìn)行治療干預(yù)已成為AD學(xué)界的共識(shí)。

1 MicroRNA與AD

MicroRNA(miR)是一種長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的5'端帶磷酸基團(tuán)、3'端帶羥基的內(nèi)源性非編碼小RNA，在生物體內(nèi)具有重要作用。利用生物信息學(xué)的方法估計(jì)生物體內(nèi)約有1/3編碼蛋白的基因受miR的調(diào)控〔7〕。已有多項(xiàng)研究表明，miR與AD有很重要的關(guān)系。miR在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白(APP)的表達(dá)及影響Aβ沉積〔8～11〕，在AD的轉(zhuǎn)基因小鼠模型里也檢測(cè)到miR對(duì)AD的影響〔12,13〕。miR還能夠影響Tau蛋白的過度磷酸化〔14〕,細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1)被認(rèn)為是Tau蛋白磷酸化過程中的關(guān)鍵酶，在鼠的神經(jīng)細(xì)胞中miR-15家族能調(diào)節(jié)ERK1的表達(dá)，從而影響Tau蛋白磷酸化的過程。而在AD患者的腦中miR-15家族的表達(dá)量明顯減少，可見miR通過影響Tau蛋白的磷酸化在AD的發(fā)病過程中起著重要的作用〔15〕。故miR可能成為AD治療工具和診斷特別是早期診斷的標(biāo)志物。

2 腦脊液 miR檢測(cè)分析及研究進(jìn)展

早在2008年，Cogswell等〔16〕通過實(shí)驗(yàn)和查文獻(xiàn)等方法揭示了腦內(nèi)變化的miR可通過淀粉樣作用、神經(jīng)生成、胰島素抵抗及先天性免疫方面的途徑影響AD的發(fā)病機(jī)制；而且發(fā)現(xiàn)CSF的miRs和腦內(nèi)miR的變化一致；腦脊液又具有取材方面的優(yōu)點(diǎn)，因此在腦脊液中尋找特異性miRs是可行的，為尋找診斷AD 的早期標(biāo)志物帶來了一種思路。

2013年，胡國(guó)艷等〔17〕利用miR芯片就10例AD患者和認(rèn)知正常老年人腦脊液的miR表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)和初步生物信息學(xué)分析，用Real-Time PCR驗(yàn)證miR芯片檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果miR芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在AD患者和認(rèn)知正常老年人腦脊液中共有128個(gè)差異表達(dá)miR，其中63個(gè)上調(diào)，下調(diào)65個(gè)；另外，應(yīng)用Real-Time PCR對(duì)miR-125b和miR-132這2個(gè)上調(diào)miR進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致，因此認(rèn)為AD患者腦脊液具有特異性的miR表達(dá)譜，提示可能在 miR表達(dá)環(huán)節(jié)找到新的AD分子標(biāo)志物。

2014年，Kiko等〔18〕用qRT-PCR的方法檢測(cè)了6種(miR-9、miR-29a、miR-29b、miR-34a、miR-125b和miR-146a)在AD患者腦中變化很大的miR，據(jù)報(bào)道，AD患者腦中miR-29a和miR-29b的減少，導(dǎo)致了腦中BACE1表達(dá)的增加，然而在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AD患者的腦脊液中miR-29a和miR-29b明顯高于正常對(duì)照組，因此猜想腦脊液中miR-29a和miR-29b可能來源于大腦，這些miRs可能是AD患者的大腦中分泌到腦脊液中去的，但是具體的原因仍待進(jìn)一步證實(shí)。miR-34a、miR-146a和miR-125b在AD患者腦中明顯升高，但在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-34a、miR-146a和miR-125b在AD患者腦脊液中是顯著減少的。因此認(rèn)為AD患者腦中miR-34a、miR-146a和miR-125b是不能被分泌到發(fā)現(xiàn)AD患者腦脊液中的。同樣在AD患者腦中富含miR-9，但是在AD患者腦脊液卻沒有miR-9水平的變化。提示可能是這些miR的釋放方式不同。這個(gè)實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探索腦脊液中AD分子標(biāo)志物提供了可能。

2015年van Harten等〔19〕發(fā)現(xiàn)miR-139-5p、miR-519-3p和miR-181-5p在AD病人的腦脊液中表達(dá)水平比較低，而miR-590-5p和miR-223-5p在AD病人的腦脊液中表達(dá)水平增高。在65歲以上的遲發(fā)性AD中，7種miR呈現(xiàn)出明顯的不同，在65歲以下的早發(fā)型AD中12種miR呈現(xiàn)出明顯的不同miR-532-3p在早發(fā)型AD中有重要作用。經(jīng)過各種實(shí)驗(yàn)證實(shí)，認(rèn)為在遲發(fā)性AD中l(wèi)et-7a最可能成為標(biāo)志物，并認(rèn)為let-7a功能上可能與APP的表達(dá)有關(guān)。而在早發(fā)型AD中則認(rèn)為miR-532-3p最可能。

同年Müller等〔20〕通過定量PCR，檢測(cè)腦脊液中miR-27a、miR-29a、miR-29b和miR-125b的含量及通過血細(xì)胞刺激法分析發(fā)現(xiàn)，在無細(xì)胞的腦脊液中，miR-27a的水平與對(duì)照組無明顯差異，這與之前研究的AD病人腦脊液中miR-27a的表達(dá)水平降低是不同的，一種可能的原因是腦脊液中細(xì)胞的影響。而AD病人無細(xì)胞腦脊液中miR-29a的表達(dá)水平是顯著上調(diào)的，有效區(qū)別了對(duì)照組與AD患者。但是當(dāng)腦脊液中有血細(xì)胞影響時(shí)，miR-29a的表達(dá)水平卻出現(xiàn)明顯下降。AD病人無細(xì)胞腦脊液中miR-125b是輕微上調(diào)的，但是它基本不受腦脊液血細(xì)胞的影響。而且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-27a和miR-29a的水平受腦脊液中血細(xì)胞的影響是十分迅速的，這對(duì)腰穿檢測(cè)無細(xì)胞腦脊液中這些miR帶來了巨大的挑戰(zhàn)，盡管如此，miR-29a還是一個(gè)有希望的AD 分子標(biāo)志物〔20〕。

3 血清 miR檢測(cè)分析及研究進(jìn)展

在2012年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在大部分AD患者的血清中miR-137、miR-181c、miR-9、miR-29a和miR-29b的水平下調(diào)〔21〕，為尋找血清學(xué)AD診斷標(biāo)志物提供了依據(jù)，2014年Tan等〔22〕用qRT-PCR的方法對(duì)miR-9、miR-29a、miR-29b、miR-101、miR-125b和miR-181c進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-125b和miR-181c的水平下調(diào)，而miR-9的水平是上調(diào)的。并且繪制受試者工作特征曲線顯示miR-125b具有68.3%的特異性和80.8%的敏感性，更重要的是血清中miR-125b的水平與AD患者的MMSE評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。因此認(rèn)為miR-125b可能成為AD的無創(chuàng)血清標(biāo)志物。

2014年，Tan等〔23〕用qRT-PCR的方法檢測(cè)了6種(miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p)在AD患者與對(duì)照組具有明顯差異的miR。其中miR-342-3p的改變最具敏感性和特異性，且血清中miR-342-3p的含量越高，患者的認(rèn)知能力下降越嚴(yán)重，病程越長(zhǎng)，這可能對(duì)疾病的發(fā)展和預(yù)后判斷提供了幫助。2015年Xie等〔24〕用qRT-PCR方法定量檢測(cè)了miR-206、miR-132、miR-193b、miR-130b、miR-20a、miR-296和miR-329的水平，發(fā)現(xiàn)miR-206和miR-132在MCI患者血清中明顯升高；ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-206和miR-132的聯(lián)合檢測(cè)產(chǎn)生最大的曲線下面積。他們還應(yīng)用TargetScan等生物信息檢索系統(tǒng)預(yù)測(cè)靶基因，用DAVID方法識(shí)別生物學(xué)過程。生物信息顯示BDNF和SIRT1是miR-206和miR-132的靶基因。在MCI的患者血清中BDNF和SIRT1的表達(dá)下調(diào)與miR-206和miR-132的上調(diào)是一致的。BDNF 和 SIRT1與學(xué)習(xí)和記憶功能有關(guān)。因此認(rèn)為miR-206和miR-132的聯(lián)合檢測(cè)可能成為MCI患者的最佳血清學(xué)標(biāo)志物。同年，Dong〔25〕又用高通量測(cè)序技術(shù)篩查了AD與正常對(duì)照組血清中的miR的表達(dá)情況，并在個(gè)體水平用RT-qPCR方法證實(shí)了發(fā)生改變的miR。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，AD患者血清中有四個(gè)miR(miR-31、miR-93、miR-143和miR-146a)發(fā)生顯著性降低。應(yīng)用ROC曲線分析方法顯示這四種miR可能成為AD潛在的標(biāo)志物。

4 外吐小體內(nèi)miR檢測(cè)對(duì)AD診斷的價(jià)值

2015年，本實(shí)驗(yàn)室使用超速離心法提取癡呆期AD患者(DAT)、輕度認(rèn)知障礙患者(MCI)和健康對(duì)照組血清和腦脊液外吐小體并檢測(cè)其miR-193b水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCI和DAT患者腦脊液及血清外吐小體內(nèi)miR-193b水平均低于對(duì)照組，且DAT組低于MCI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔26〕。因此認(rèn)為血清外吐小體內(nèi)miR-193b可能為AD，特別是早期診斷AD的標(biāo)志物。但該研究仍屬于小樣本研究且未納入pre-MCI受試者，因此外吐小體內(nèi)miR是否能夠成為AD的早期診斷標(biāo)志物有待于進(jìn)一步研究。

體液miR的來源眾多，包括凋亡和壞死的組織細(xì)胞的miR釋放。細(xì)胞的被動(dòng)滲漏和主動(dòng)分泌等〔27〕。人體中運(yùn)輸miR的載體主要包括蛋白；脂蛋白以及微囊泡和外吐小體等。其中外吐小體可在分泌細(xì)胞的支配下主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)特定的miR，此類循環(huán)miR可看做是某些細(xì)胞經(jīng)由外吐小體這一載體向靶細(xì)胞發(fā)送的信息，那么他的表達(dá)是否具有專一性，能否成為AD檢測(cè)的標(biāo)志物呢，有待于我們?nèi)パ芯俊?/p>

而且雖然目前尚無直接的證據(jù)證實(shí)miR能自由的通過血腦屏障，但研究表明組成血腦屏障的細(xì)胞可主動(dòng)分泌微囊泡和外吐小體〔28,29〕，這些微囊泡和外吐小體內(nèi)可能包含有腦組織向外周組織或是外周組織向腦組織所傳遞的信號(hào)。因此，了解外吐小體內(nèi)miR表達(dá)水平的變化可能較體液總miR測(cè)定更有利于疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè)。

5 結(jié) 語(yǔ)

越來越多的研究表明，體液miR對(duì)于AD的診斷和治療具有較大的潛在價(jià)值〔30,31〕。雖然CSF直接接觸腦組織，較血液尿液而言其更能反映中樞系統(tǒng)的病理生理改變，但臨床醫(yī)生和檢驗(yàn)工作者不得不面對(duì)的是，對(duì)于已經(jīng)出現(xiàn)明顯臨床癥狀的AD患者，其神經(jīng)心理學(xué)評(píng)分往往已經(jīng)出現(xiàn)異常，這時(shí)對(duì)其進(jìn)行CSF的抽取和檢驗(yàn)往往得不到患者和家屬的認(rèn)可。故血液、尿液等較易獲得的體液標(biāo)本中是否存在能作為AD特別是早期AD檢測(cè)標(biāo)志物將成為AD診斷研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。

1 Mega MS,Cummings JL,Fiorello T,etal.The spectrum of behavioral changes in Alzheimer's disease〔J〕.Neurology,1996;46(1):130-5.

2 F?rstl H,Kurz A.Clinical features of Alzheimer's disease〔J〕.Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci,1999;249(6):288-90.

3 付正興.老年癡呆癥發(fā)病機(jī)制及其藥物治療〔J〕.心血管病防治知識(shí)：學(xué)術(shù)版,2014;(8):122-3.

4 張艷娟,王 迎,呂 程.老年癡呆癥的早期預(yù)防研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué),2014;23(1):14-5.

5 Sharma AK,Kim J,Prior JT,etal.Small bifunctional chelators that do not disaggregate amyloid β fibrils exhibit reduced cellular toxicity〔J〕.Inorg Chem,2014;53(21):11367-76.

6 Lee JH,Kahn A,Cheng R,etal.Disease-related mutations among Caribbean Hispanics with familial dementia〔J〕.Mol Genet Genomic Med,2014;2(5):430-7.

7 Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets〔J〕.Cell,2005;120(1):15-20.

8 Long JM,Ray B,Lahiri DK.MicroRNA-153 physiologically inhibits expression of amyloid-β precursor protein in cultured human fetal brain cells and is dysregulated in a subset of Alzheimer disease patients〔J〕.J Biol Chem,2012;287(37):31298-310.

9 Long JM,Lahiri DK.MicroRNA-101 downregulates Alzheimer's amyloid-β precursor protein levels in human cell cultures and is differentially expressed〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2011;404(4):889-95.

10 Vilardo E,Barbato C,Ciotti M,etal.MicroRNA-101 regulates amyloid precursor protein expression in hippocampal neurons〔J〕.J Biol Chem,2010;285(24):18344-51.

11 Fang M,Wang J,Zhang X,etal.The miR-124 regulates the expression of BACE1/β-secretase correlated with cell death in Alzheimer's disease〔J〕.Toxicol Lett,2012;209(1):94-105.

12 Hébert SS,Horré K,Nicola? L,etal.MicroRNA regulation of Alzheimer's Amyloid precursor protein expression〔J〕.Neurobiol Dis,2009;33(3):422-8.

13 Wang X,Liu P,Zhu H,etal.miR-34a,a microRNA up-regulated in a double transgenic mouse model of Alzheimer's disease,inhibits bcl2 translation〔J〕.Brain Res Bull,2009;80(4-5):268-73.

14 Hébert SS,Sergeant N,Buée L.MicroRNAs and the regulation of Tau metabolism〔J〕.Int J Alzheimers Dis,2012;2012:406561.

15 Hébert SS,Papadopoulou AS,Smith P,etal.Genetic ablation of Dicer in adult forebrain neurons results in abnormal tau hyperphosphorylation and neurodegeneration〔J〕.Hum Mol Genet,2010;19(20):3959-69.

16 Cogswell JP,Ward J,Taylor IA,etal.Identification of miRNA changes in Alzheimer's disease brain and CSF yields putative biomarkers and insights into disease pathways〔J〕.J Alzheimers Dis,2008;14(1):27-41.

17 胡國(guó)艷,李 萍,何柯新,等.阿爾茨海默病患者腦脊液miR檢測(cè)及初步分析〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2013;29(6):992-4.

18 Kiko T,Nakagawa K,Tsuduki T,etal.MicroRNAs in plasma and cerebrospinal fluid as potential markers for Alzheimer's disease〔J〕.J Alzheimers Dis,2014;39(2):253-9.

19 van Harten AC,Mulders J,Scheltens P,etal.Differential expression of MicroRNA in cerebrospinal fluid as a potential novel biomarker for Alzheimer's disease〔J〕.J Alzheimers Dis,2015;47(1):243-52.

20 Müller M,J?kel L,Bruinsma IB,etal.MicroRNA-29a is a candidate biomarker for Alzheimer's disease in cell-free cerebrospinal fluid〔J〕.Mol Neurobiol,2016;53(5):2894-9.

21 Geekiyanage H,Jicha GA,Nelson PT,etal.Blood serum miRNA:non-invasive biomarkers for Alzheimer's disease〔J〕,Exp Neurol,2012;235(2):491-6.

22 Tan L,Yu JT,Liu QY,etal.Circulating miR-125b as a biomarker of Alzheimer's disease〔J〕.J Neurol Sci,2014;336(1-2):52-6.

23 Tan L,Yu JT,Tan MS,etal.Genome-wide serum microRNA expression profiling identifies serum biomarkers for Alzheimer's disease 〔J〕.J Alzheimers Dis,2014;40(4):1017-27.

24 Xie B,Zhou H,Zhang R,etal.Serum miR-206 and miR-132 as potential circulating biomarkers for mild cognitive impairment 〔J〕.J Alzheimers Dis,2015;45(3):721-31.

25 Dong H,Li J,Huang L,etal.Serum MicroRNA profiles serve as novel biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease〔J〕.Dis Markers,2015;2015:625659.

26 劉辰庚,張躍其，王培昌，等.外吐小體內(nèi) microRNA-193b 在阿爾茨海默病患者中的檢測(cè)〔J〕.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2015;25(16):2301-3.

27 Ma R,Jiang T,Kang X.Circulating MicroRNAs in cancer:origin,function and application.〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2012;31:38.

28 O'Loughlin AJ,Woffindale CA,Wood MJ,etal.Exosomes and the emerging field of exosome-based gene therapy〔J〕.Curr Gene Ther,2012;12(4):262-74.

29 Zhang X,Zhao L,Wu J,etal.Current advances in vehicles for brain gene delivery〔J〕.Curr Gene Ther,2012;12(5):423-36.

30 Fagan AM,Perrin RJ.Upcoming candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease〔J〕.Biomark Med,2012;6(4):455-76.

31 Dorval V,Nelson PT,Hébert SS.Circulating microRNAs in Alzheimer's disease:the search for novel biomarkers〔J〕.Front Mol Neurosci,2013;6:24.

〔2016-01-19修回〕

(編輯 曲 莉)

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(No.81401734)

王培昌(1965-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事衰老及相關(guān)疾病機(jī)制研究及標(biāo)志物篩選。

楊婷婷(1992-)，女，碩士，主要從事衰老及相關(guān)疾病標(biāo)志物篩選研究。

R741.02

A

1005-9202(2016)20-5190-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.124