反復(fù)種植失敗患者周圍血樹突狀細(xì)胞數(shù)量和功能分析①

曾　勇　黃春宇　陳　現(xiàn)　梁佩燕　刁梁輝　陳　聰　張　谞　尹　彪

(深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,中山生殖與遺傳研究所，深圳518045)

反復(fù)種植失敗患者周圍血樹突狀細(xì)胞數(shù)量和功能分析①

曾勇②黃春宇②陳現(xiàn)②梁佩燕②刁梁輝②陳聰②張谞②尹彪②

(深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,中山生殖與遺傳研究所，深圳518045)

[摘要]目的：了解反復(fù)種植失敗(Repeated implantation failure,RIF)患者周圍血樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)數(shù)量和功能的變化。方法：采集30例RIF患者及15例正常對(duì)照組的黃體中期周圍血，采用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)對(duì)其DC細(xì)胞功能分子及亞群進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，RIF患者的lin-HLA-DR+DC細(xì)胞占白細(xì)胞的比例無顯著性變化(P>0.05)，DC細(xì)胞表面的共刺激分子(CD80和CD86)以及免疫耐受分子CD200也無顯著性變化(P>0.05)。然而，RIF患者中CD11c+CD123-mDC細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)，而CD11c-CD123+pDC細(xì)胞比例無顯著性變化(P>0.05)。 結(jié)論：RIF患者的周圍血mDC細(xì)胞比例顯著升高，其可能是影響RIF患者妊娠結(jié)局的因素之一。

[關(guān)鍵詞]母胎免疫耐受；反復(fù)種植失敗；周圍血；樹突狀細(xì)胞

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)評(píng)估，目前生殖障礙的發(fā)生率約為15%。隨著體外受精-胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)技術(shù)的發(fā)展，生殖障礙得到了明顯的改善。但是，在IVF 治療過程中，排除高齡、生殖系統(tǒng)畸形、遺傳、內(nèi)分泌等異常因素后仍有10%~15%左右的患者經(jīng)過多個(gè)周期治療后仍然未能成功妊娠，通常這部分患者被定義為反復(fù)種植失敗(Repeated implantation failure,RIF)[1]。研究證明，胚胎的種植與母體免疫環(huán)境息息相關(guān)，機(jī)體的免疫細(xì)胞參與調(diào)控胚胎的種植過程[1]。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)作為機(jī)體重要的抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell,APC)，在正常妊娠中發(fā)揮重要作用。其中主要包括：(1) DC細(xì)胞通過低表達(dá)表面共刺激分子(CD80、CD86)[2]和高表達(dá)表面耐受分子(CD200)誘導(dǎo)母體對(duì)胎兒的免疫耐受[3]；(2)不同的DC細(xì)胞亞群，髓樣DC細(xì)胞(myeloid DC,mDC)和漿細(xì)胞樣DC細(xì)胞(plasmacytoid DC,pDC)，通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化方向參與母胎免疫對(duì)話[4]；并且，有文獻(xiàn)報(bào)道，在小鼠的種植窗期去除DC細(xì)胞，其著床位點(diǎn)的形成受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎著床失敗[5]。這些結(jié)果共同提示DC細(xì)胞的異?？赡苁怯绊慠IF發(fā)生的重要因素。因此，本研究擬對(duì)RIF患者DC細(xì)胞的數(shù)量及其表面分子進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)而為尋找新的母胎免疫致病因素，為尋找RIF患者治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象本研究選取2013年3月至2014年10月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心接受治療的不孕不育患者為研究對(duì)象，年齡為23~35歲。所有患者均經(jīng)過詳細(xì)詢問病史、染色體核型分析、全身及婦科檢查以及內(nèi)分泌等系統(tǒng)性檢查。其中，正常對(duì)照組15人，RIF患者30人。

正常對(duì)照組的入選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)男方因素(無精、少精、畸精)所致不孕而進(jìn)行第一周期IVF的患者；(2)第一個(gè)移植周期成功妊娠；(3)夫婦雙方染色體正常；(4)女方生殖解剖結(jié)構(gòu)正常、內(nèi)分泌正常、無自身免疫性疾病，月經(jīng)規(guī)律；(5)使用常規(guī)促排卵方案，排卵日內(nèi)膜厚度≥8 mm，雙側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)均≥8個(gè)。

RIF患者的入選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)符合RIF的定義：經(jīng)歷2次以上失敗的移植周期且所移植總優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)≥6個(gè)；或經(jīng)歷3個(gè)以上取卵周期且每個(gè)周期均移植優(yōu)質(zhì)胚胎仍未取得臨床妊娠；(2)夫婦雙方染色體正常；(3)女方生殖解剖結(jié)構(gòu)正常、內(nèi)分泌正常、無自身免疫性疾病、無高凝傾向；(4)男方精液檢查正常。

所有患者在同意并進(jìn)入檢查流程的第一個(gè)月經(jīng)周期的黃體中期采集周圍血，檢測(cè)其中DC細(xì)胞比例、DC細(xì)胞亞群比例以及DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)水平。本研究入選患者均簽署了知情同意書，實(shí)驗(yàn)流程獲得醫(yī)院學(xué)術(shù)與倫理學(xué)委員會(huì)許可。

1.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑FACS流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品，臺(tái)式低速離心機(jī)為德國eppendorf公司產(chǎn)品。主要試劑包括流式抗體lin 1-FITC (CD3,CD14,CD16,CD19,CD20,CD56-FITC)、HLA-DR-Percp、CD11c-APC、CD123-PE、CD80-PE、CD86-PE、CD200-PE，同型對(duì)照mouse IgG-PE以及FACS紅細(xì)胞裂解液，均購于美國Becton Dickinson公司；新生牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DC細(xì)胞比例的檢測(cè)將100 μl乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血加入到流式管中；然后加入10 μl lin 1-FITC、10 μl HLA-DR-Percp，振蕩混勻，避光、室溫孵育15 min；加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，避光孵育10 min；1 300 r/min,6 min進(jìn)行細(xì)胞離心，去上清；加入含有5% 血清的PBS 2 ml充分混勻，1 300 r/min,6 min進(jìn)行細(xì)胞離心，去上清；加入200 μl PBS進(jìn)行細(xì)胞重懸；利用FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(BD，美國)進(jìn)行檢測(cè)并用并用FlowJo軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.2DC細(xì)胞表面CD80和CD86表達(dá)水平的檢測(cè)將100 μl乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血分別加入三支流式管中；其中管1中加入10 μl lin 1-FITC、10 μl HLA-DR-Percp、20 μl mouse IgG-PE，作為陰性對(duì)照組；管2中加入10 μl lin 1-FITC、10 μl HLA-DR-Percp、20 μl CD80-PE，管3中加入10 μl lin 1-FITC、10 μl HLA-DR-Percp、20 μl CD86-PE，作為實(shí)驗(yàn)組，振蕩混勻，避光、室溫孵育15 min；加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，避光孵育10 min；1 300 r/min,6 min進(jìn)行細(xì)胞離心，去上清；加入含有5% 血清的PBS 2 ml充分混勻，1 300 r/min,6 min進(jìn)行細(xì)胞離心，去上清；加入200 μl PBS進(jìn)行細(xì)胞重懸；利用FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(BD，美國)進(jìn)行檢測(cè)并用FlowJo軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.3DC細(xì)胞表面CD200表達(dá)水平的檢測(cè)其實(shí)驗(yàn)步驟及檢測(cè)方法與實(shí)驗(yàn)方法1.2.2相同，其中同型對(duì)照為mouse IgG-PE，實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)抗體為CD200-PE。

1.2.4DC細(xì)胞亞群比例的檢測(cè)將100 μl乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血加入到流式管中；然后加入10 μl lin 1-FITC、10 μl HLA-DR-Percp、5 μl CD123-PE、5 μl CD11c-APC，振蕩混勻，避光、室溫孵育15 min；加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，避光孵育10 min；1 300 r/min,6 min進(jìn)行細(xì)胞離心，去上清；加入含有5% 血清的PBS 2 ml充分混勻，1 300 r/min,6 min進(jìn)行細(xì)胞離心，去上清；加入200 μl PBS進(jìn)行細(xì)胞重懸；利用FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(BD，美國)進(jìn)行檢測(cè)和FlowJo軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2結(jié)果

2.1RIF患者DC細(xì)胞數(shù)量分析圖1A為兩色標(biāo)記檢測(cè)樹突狀細(xì)胞比例的示意圖。lin-HLA-DR+的細(xì)胞即為DC細(xì)胞。圖1B顯示，與正常對(duì)照組相比，RIF患者的lin-HLA-DR+DC細(xì)胞占白細(xì)胞比例無顯著性差異[(1.03±0.25)% vs (0.96 ±0.36)%，P> 0.05]。

2.2FCM 檢測(cè)RIF患者DC細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)水平分析RIF患者中DC細(xì)胞的抗原提呈能力是否發(fā)生變化，F(xiàn)CM檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，RIF患者中DC細(xì)胞表面共刺激分子CD80[(4.15±3.36)% vs (4.07±3.84)%，P>0.05，圖2A、B]和CD86[(63.33±9.02)% vs (56.84±8.36)%，P>0.05，圖2C、D]的表達(dá)水平均無顯著性差異。

2.3FCM 檢測(cè)RIF患者DC細(xì)胞表面CD200表達(dá)水平進(jìn)一步分析RIF患者中DC細(xì)胞的免疫耐受功能是否發(fā)生改變，本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)介導(dǎo)DC細(xì)胞免疫耐受功能的CD200分子進(jìn)行檢測(cè)(圖3A)。FCM結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，RIF患者DC細(xì)胞表面CD200的表達(dá)水平[(33.66±11.98)% vs (37.85±14.01) %]有下降趨勢(shì)，但是并無顯著性差異(P>0.05,圖3B)。

2.4FCM 檢測(cè)RIF患者DC細(xì)胞亞群比例圖4A為四色標(biāo)記檢測(cè)樹突狀細(xì)胞亞群比例的示意圖。

lin-HLA-DR+的細(xì)胞即為DC細(xì)胞，其中，CD11c+CD123-的細(xì)胞為mDC，CD11c-CD123+的細(xì)胞為pDC。FCM結(jié)果顯示，RIF患者CD11c+CD123-mDC細(xì)胞比例顯著高于正常對(duì)照組[(49.83±8.94) % vs (43.71±7.43) %，P<0.05，圖4B]；而CD11c-CD123+pDC細(xì)胞比例在兩組之間無顯著性差異[(33.82±12.29) % vs (31.53±9.16) %，P>0.05,圖4C)]。

3討論

胚胎植入是生殖過程的重要環(huán)節(jié)，是影響妊娠結(jié)局的關(guān)鍵步驟。胚胎植入是胚胎與母體相互識(shí)別、相互融合的復(fù)雜過程，受多種因素調(diào)控，而其中母體免疫狀態(tài)的穩(wěn)定尤為重要。對(duì)于母體來說，胚胎是一種異體移植物，其能夠被母體正確識(shí)別而不受到排斥，此過程中母體的免疫耐受環(huán)境是必不可少的[6]。一旦機(jī)體免疫細(xì)胞數(shù)量或者功能失衡，免疫耐受環(huán)境受到破壞，母體可能會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生排斥，進(jìn)而導(dǎo)致種植失敗[7]。研究表明，DC細(xì)胞是免疫機(jī)制的重要調(diào)節(jié)成分，并且在免疫耐受和免疫源性耐受中發(fā)揮重要作用[8,9]。此外，Plaks等[5]報(bào)道，在小鼠的種植窗期去除DC細(xì)胞，其著床位點(diǎn)的形成受到抑制，導(dǎo)致胚胎著床失敗。由此推測(cè)，DC細(xì)胞介導(dǎo)免疫耐受的功能在胚胎種植過程中發(fā)揮重要作用。然而，DC細(xì)胞在RIF患者中的數(shù)量和功能狀態(tài)還未見報(bào)道。

DC細(xì)胞是一類與粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞形態(tài)和功能都不同的白細(xì)胞，它們可以與T細(xì)胞、B細(xì)胞相互作用，以刺激和控制適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。DC細(xì)胞數(shù)量與多種免疫性紊亂疾病相關(guān)，其中包括惡性腫瘤和慢性病毒感染等[10，11]。本研究結(jié)果顯示，RIF患者中DC細(xì)胞比例并無顯著性變化，由此提示，DC細(xì)胞數(shù)量可能并不是胚胎種植失敗的關(guān)鍵因素。然而，文獻(xiàn)報(bào)道，除了DC細(xì)胞數(shù)量之外，介導(dǎo)DC細(xì)胞免疫耐受的表面分子在妊娠中也發(fā)揮了必不可少的作用。CD80和CD86是DC細(xì)胞的共刺激分子，其與MHC類分子協(xié)同向T細(xì)胞傳遞抗原信號(hào)，進(jìn)而啟動(dòng)T細(xì)胞免疫反應(yīng)[12]。研究證明，正常妊娠中，母體DC細(xì)胞表面的共刺激分子CD80和CD86表達(dá)下調(diào)，降低其對(duì)胚胎的抗原提呈作用，抑制T細(xì)胞對(duì)胚胎的免疫排斥反應(yīng)，進(jìn)而形成母體對(duì)同種異體胚胎的免疫耐受[2]。然而，RIF患者周圍血中DC細(xì)胞的抗原提呈能力還未見報(bào)道。因此，本研究對(duì)RIF患者DC細(xì)胞表面共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD80和CD86的表達(dá)水平在RIF患者與正常對(duì)照組之間并無顯著性差異。由此推測(cè)，RIF患者中DC細(xì)胞的共刺激分子表達(dá)正常，其可能并不是影響RIF患者妊娠結(jié)局的因素。

CD200是與免疫細(xì)胞共刺激分子相關(guān)的表面蛋白。作為共刺激分子(CD80和CD86)的對(duì)立分子，其是免疫耐受信號(hào)通路中的重要角色[13]。研究證明，DC細(xì)胞表面的CD200通過與其受體CD200R相互結(jié)合，促進(jìn)吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO) 的表達(dá)，進(jìn)而抑制活性T細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)方向分化，介導(dǎo)免疫耐受的形成[3]。因此，本研究對(duì)RIF患者DC細(xì)胞表面CD200的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RIF患者與正常對(duì)照組相比，CD200的表達(dá)水平有下降的趨勢(shì)，但是不具有顯著性差異。此陰性結(jié)果有可能是由于樣本量較小造成的，所以，后續(xù)還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對(duì)此結(jié)果進(jìn)行確證。

研究證明，DC不僅可以通過調(diào)控表面共刺激分子和免疫耐受分子的表達(dá)進(jìn)而參與妊娠過程，還具有發(fā)揮不同免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞亞群。根據(jù)細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況，DC細(xì)胞可以分為mDC和pDC兩大類。其中，mDC表達(dá)CD11c，并且分泌白介素-12 (Interlukin-12,IL-12)等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)輔助性T (T helper,Th)細(xì)胞向Th1分化[14]；而pDC表達(dá)CD123，分泌Ⅰ型干擾素(InterferonⅠ,IFN Ⅰ) 和IL-10等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)Th細(xì)胞向Th2分化[15,16]。大量研究表明，正常妊娠中，機(jī)體的免疫狀態(tài)偏向于“Th2型”反應(yīng)[17-19]。當(dāng)機(jī)體的mDC升高或pDC數(shù)量降低時(shí)，機(jī)體免疫環(huán)境可能偏向于“Th1型”反應(yīng)，進(jìn)而引起先兆子癇等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[20]。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)RIF患者周圍血中DC細(xì)胞亞群比例進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RIF患者中mDC占DC細(xì)胞的比例顯著高于正常對(duì)照組，而pDC細(xì)胞亞群比例在兩組之間無顯著差異。前期研究報(bào)道妊娠期間低水平的mDC數(shù)量在維持母體對(duì)胚胎的免疫耐受中發(fā)揮重要作用[4]。以上結(jié)果共同提示，RIF患者確實(shí)存在DC細(xì)胞亞群失衡的狀況，而且mDC比例的升高可能是影響RIF患者不良妊娠結(jié)局的因素之一。

但是，本研究結(jié)果并未闡明DC細(xì)胞數(shù)量變化與妊娠結(jié)局之間的相關(guān)性，及其影響妊娠結(jié)局的具體機(jī)制。所以，本實(shí)驗(yàn)室擬繼續(xù)進(jìn)行以下研究：(1)分析RIF患者周圍血mDC細(xì)胞數(shù)量與Th1型細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性，及其與RIF患者下一個(gè)移植周期妊娠結(jié)局的相關(guān)性，從而觀察周圍血mDC是否通過調(diào)節(jié)母體促炎狀態(tài)進(jìn)而影響妊娠結(jié)局；(2)利用免疫組化技術(shù)對(duì)RIF患者黃體中期子宮內(nèi)膜中DC細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，并與對(duì)照組進(jìn)行比較；分離純化兩組人群的子宮內(nèi)膜DC細(xì)胞，并分別與滋養(yǎng)層細(xì)胞系進(jìn)行共培養(yǎng)，分析并比較其對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等的影響。

綜上所述，RIF患者中周圍血DC細(xì)胞數(shù)量及其表面調(diào)節(jié)分子水平無顯著性變化，而mDC數(shù)量顯著高于正?？稍袐D女，其異?？赡軐?dǎo)致了RIF患者不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，但是具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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[收稿2015-04-22修回2015-06-24]

(編輯張曉舟)

Analysis of quantity and function of dendritic cells in peripheral blood of patients with repeated implantation failure

ZENGYong,HUANGChun-Yu,CHENXian,LIANGPei-Yan,DIAOLiang-Hui,CHENCong,ZHANGXu,YINBiao.FertilityCenterofShenzhenZhongshanUrologyHospital,ShenzhenZhongshanInstituteforReproductiveMedicineandGenetics,Shenzhen518045,China

[Abstract]Objective:To evaluate the quantity and function changes of dendritic cells (DC) in peripheral blood of patients with repeated implantation failure (RIF).Methods: 30 patients with RIF and 15 normal controls were enrolled in this study,and the peripheral blood was collected during the mid-luteal phase.The percentage of DC subsets and the expression levels of functional molecules were assessed by flow cytometric analysis.Results: Compared with normal controls,the percentage of lin-HLA-DR+DC cells accounting for leukocytes in patients with RIF was not significantly different (P>0.05).There were also no significant differences in the expression levels of co-stimulatory molecules (CD80 and CD86) and immune tolerant molecules CD200 on DC cells surfaces between patients with RIF and normal controls (all P>0.05).In addition,the percentage of CD11c+CD123-mDC accounting for DC cells was significantly increased in patients with RIF (P<0.05),however,the percentage of CD11c-CD123+pDC was similar (P>0.05).Conclusion: The percentage of mDC accounting for DC cells was significantly increased in patients with RIF,which may be one of factors affecting pregnancy outcomes.

[Key words]Maternal-fetal immune tolerance；Repeated implantation failure；Peripheral blood；Dendritic cells

通訊作者及指導(dǎo)教師：尹彪(1981年-)，男，助理研究員，主要從事生殖臨床免疫與遺傳學(xué)研究，E-mail:yinbiao2004@hotmail.com。

作者簡(jiǎn)介：曾勇(1966年-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事生殖臨床及免疫研究,E-mail:zengyong1966@gmail.com。

中圖分類號(hào)R318.16
①本文為深圳市基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(JCYJ20120829150019348)。
②同時(shí)供職于深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳518045。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)02-0239-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.021