含噻唑烷-4-酮的免疫調(diào)節(jié)劑對RA患者iNKT細胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響①

孟　明　張雪嬌　甕沛杉　許鳴華　陳　丹　侯明輝　陳冬志

(河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部，保定071000)

·臨床免疫學(xué)·

含噻唑烷-4-酮的免疫調(diào)節(jié)劑對RA患者iNKT細胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響①

孟明張雪嬌甕沛杉許鳴華②陳丹侯明輝陳冬志③

(河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部，保定071000)

[摘要]目的：研究新型合成的含噻唑烷-4-酮的免疫調(diào)節(jié)劑(CH1b)對活動期RA患者iNKT細胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響。方法：從RA患者外周血中分離得到單個核淋巴細胞(PBMC)，α-Galcer和IL-2體外刺激擴增后，經(jīng)磁珠分選(MACS)得到純化的iNKT細胞，分成對照組(IL-2)、α-Galcer組(IL-2+α-Galcer)、CH1b組(IL-2+CH1b)。采用MTT法測定各組RA患者iNKT細胞增殖率；MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit檢測各組RA患者iNKT細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4的水平；采用RT-PCR方法檢測各組RA患者iNKT細胞中IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA的表達水平。結(jié)果：與對照組和α-Galcer組相比，CH1b組iNKT細胞增殖率明顯增加(P<0.05)；與對照組相比，α-Galcer組IFN-γ和IL-4分泌水平明顯增加(P<0.05)，CH1b組IFN-γ和IL-4的分泌量也明顯增加，IFN-γ/IL-4 明顯降低(P<0.05)；與對照組相比，α-Galcer組IFN-γ mRNA與IL-4 mRNA表達均明顯增高，CH1b組IFN-γ mRNA表達差異不明顯，IL-4 mRNA的表達明顯增高。結(jié)論：新型合成的免疫調(diào)節(jié)劑(CH1b)可促進活動期RA患者活化的iNKT細胞增殖，并促進IL-4的分泌，上調(diào)IL-4 mRNA的表達，誘導(dǎo)iNKT細胞向Th2方向分化，對恢復(fù)RA病人體內(nèi)免疫平衡具有重要意義。

[關(guān)鍵詞]類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；iNKT細胞；免疫調(diào)節(jié)劑；IFN-γ/IL-4

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA) 是以全身關(guān)節(jié)部位的慢性炎癥和骨質(zhì)破壞為主要病理特征的自身免疫性疾病，RA發(fā)病機制復(fù)雜，多種免疫細胞參與了RA的發(fā)病過程。目前認為：Th1/Th2細胞功能失衡導(dǎo)致的過度炎癥可能是RA發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。RA患病率達1%，致殘率超過腦血管疾病，目前尚缺乏特效的RA藥物和治療手段[1]。

近年發(fā)現(xiàn)，恒定自然殺傷T細胞(invariant nature killer T,iNKT)在自身免疫性疾病中有重要作用，并且與RA發(fā)病密切相關(guān)。iNKT細胞具有雙向調(diào)節(jié)的特點,既可以通過分泌多種細胞因子影響T細胞、NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)的功能，又能夠直接殺傷腫瘤等靶細胞[2]。iNKT細胞通過調(diào)節(jié)Th1亞群與Th2亞群之間的平衡，來維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。目前多項研究結(jié)果表明，RA的發(fā)病可能與iNKT細胞數(shù)量和分泌細胞因子功能異常有關(guān)[3-5]。免疫調(diào)節(jié)劑是一類能非特異性地增強或抑制機體免疫功能的新型藥物，通過與免疫系統(tǒng)各種淋巴細胞間的相互作用或免疫分子內(nèi)在的網(wǎng)絡(luò)活化作用,調(diào)整機體免疫功能、糾正免疫紊亂,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床治療[6]。本課題組前期設(shè)計、合成了一系列含噻唑烷酮的糖類衍生小分子免疫調(diào)節(jié)劑。前期實驗結(jié)果顯示:這類結(jié)構(gòu)新穎的免疫調(diào)節(jié)劑具有促進T細胞增殖、NK 細胞殺傷活性,還能夠提升巨噬細胞功能等方面的免疫調(diào)節(jié)活性[7，8]。

本課題在前期研究的基礎(chǔ)上進一步探討含噻唑烷酮的糖類衍生小分子免疫調(diào)節(jié)劑CH1b對活動期RA患者iNKT細胞的影響，以便了解此類免疫調(diào)節(jié)劑是否能夠促進RA患者iNKT細胞功能，從而為開拓此類免疫調(diào)節(jié)劑潛在性的RA治療作用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象選擇50例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病例(均為2012年11月至2014年7月期間于河北大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的病人),男20例，女30例，年齡在16~63歲，平均為(50.94±2.14)歲，所有 RA 病例均符合2010年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(EULAR)修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)[9]。依據(jù)疾病活動性評分28(Disease activity score 28，DAS28) 來評估疾病活動性，評分為2.6~5的歸為活動期RA[10]。上述研究得到河北大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.1.2試劑與儀器細胞培養(yǎng)液 RPMI1640、胎牛 血清(FBS)、PBS 為 Invitrogen 公司產(chǎn)品；PCR儀購自Bio-Rad Company(Hercules,California,USA)公司。Ficoll-PaqueTMPlus、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)購自Sigma公司。MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit購自Merk Millipore(Massachusetts,USA)。Anti-iNKT MicroBeads(Human)、Anti-iNKT-PE(抗人TCRVα24鏈抗體)和Human IL-2購自Mihenyi Biotec (Mihenyi Biotec，GmbH)公司。CD3-FITC及同型IgG1抗體購自BD Pharmingen(CA，USA)。α-Galcer購自ENZO Life Sciences公司。PCR擴增試劑盒購自Tansgene Company (Strasbourg,France)。引物由華大科技公司合成。

1.2方法

1.2.1外周血單個核細胞制備采集活動期RA病人外周靜脈血5~10 ml,用EDTA抗凝,3 000 r/min離心5 min，吸取上層血清。向剩余血細胞中1∶1加入PBS吹打混勻，用滴管緩慢將其疊加于Ficoll-Paque分離液液面上。室溫下2 000 r/min,離心20 min。離心后用滴管小心吸取上、中層間的單核細胞(PBMC)云霧狀細胞層移入一新離心管中,加入5倍以上體積的PBS洗滌，1 000 r/min，10 min，棄上清。洗滌細胞兩次，100 ml/L胎牛血清的AIM-V培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為2×106ml-1，備用。

1.2.2iNKT細胞體外擴增將上述制備的PBMC接種于250 ml培養(yǎng)瓶。加入終濃度為100 ng/ml的α-Galcer和終濃度為100 U/ml的IL-2置于37℃，5%CO2的孵箱中進行培養(yǎng)。每4 d更換一次培養(yǎng)液，并調(diào)整細胞濃度為2×106ml-1，加入新鮮AIM-V完全培養(yǎng)基和上述終濃度的α-Galcer和IL-2繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3iNKT細胞純化及純度檢測收獲各組培養(yǎng)16~21 d的PBMC進行iNKT細胞的純化及純度檢測。分離過程嚴格按照抗人iNKT微珠提供的操作說明書操作。主要步驟如下:收集擴增后的PBMC，離心洗滌，使細胞在預(yù)冷的PBS中重懸，重懸比為每108個細胞與400 μl PBS構(gòu)成單位反應(yīng)體系;每單位反應(yīng)體系加入100 μl抗iNKT細胞磁珠進行標(biāo)記,混勻后置于4℃環(huán)境中標(biāo)記15 min。之后每單位反應(yīng)體系加入1 ml緩沖溶液洗滌,1 000 r/min離心10 min,棄上清,在500 μl預(yù)冷的PBS中重懸。然后采用LS柱進行磁珠分選。純化得到的iNKT細胞，取一部分用FITC標(biāo)記的抗人CD3抗體和PE標(biāo)記的抗人iNKT抗體進行流式檢測，iNKT細胞純度可達90%以上[11]。

經(jīng)過體外擴增后，iNKT細胞占PBMC的比例由(0.12±0.07)%增長到(0.97±0.13)%；經(jīng)過磁珠法分離純化后，每次實驗?zāi)軌虻玫郊s4×106個iNKT細胞且純度可達90%以上。

1.2.4iNKT細胞增殖實驗將分離得到的人iNKT細胞以2×106個/ml接種于96孔板，每孔90 μl。實驗設(shè)對照組(IL-2)、α-Galcer組(IL-2+α-Galcer)、CH1b組(IL-2+CH1b)。對照組加入10 μl IL-2(100 U/ml)，α-Galcer組加入10 μl IL-2(100 U/ml)及10 μl α-Galcer (100 U/ml)，CH1b組加入10 μl IL-2(100 U/ml)及10 μl最佳有效濃度的CH1b(5 μmol/L)。每組設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃，5%CO2條件培養(yǎng)68 h后，每孔加入10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，每孔加入100 μl DMSO，振蕩均勻后570 nm處測定吸光度(A)值，根據(jù)公式計算增殖率：增殖率(%)=(A給藥組-A對照組)/A對照組×100%。

1.2.5iNKT細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4含量檢測將分離得到的iNKT細胞按照上述增殖實驗條件處理，每組設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃，5%CO2條件培養(yǎng)72 h后，離心，收集上清，采用MILLIPLEX檢測各組IFN-γ和IL-4水平。

1.2.6RNA抽提及cDNA第一鏈合成分別向收獲的iNKT細胞中加入1 ml Trizol反復(fù)多次吹打,室溫靜置5 min。裂解液中加入200 μl氯仿劇烈振蕩15 s,室溫靜置5 min，4℃13 000 r/min，離心15 min。小心吸取上清水相移至另一離心管,加入等體積的異丙醇,顛倒混勻，室溫靜置10 min,4℃13 000 r/min離心10 min，去上清。加入1 ml 75%乙醇，8 000 r/min，4℃離心5 min，小心吸盡上清，干燥沉淀5 min,加入10 μl的DEPC水溶解RNA 沉淀。用紫外分光光度計測定RNA 的純度與含量，所得RNA 的A260/A280在1.8～2.0之間，RNA的濃度為(1 400±103.5)ng/μl。將RNA樣本進行逆轉(zhuǎn)錄，嚴格按照M- MLV First Strand Kit提供的操作流程進行：向PCR管中分別加入總RNA 3 μg、Olig odT 1 μl、10 mol/L dNTP 2 μl、補足DEPC水至12 μl，混合物65℃加熱5 min后，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后，加入：5×buffer 4 μl、0.1 mmol/L DTT 2 μl、核酸酶抑制劑1 μl，將各種成分混勻，37℃孵育5 min。室溫加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl并吹打混勻，37℃孵育50 min,70℃加熱15 min以終止反應(yīng)。

1.2.7PCR反應(yīng)內(nèi)參β-actin上游引物:5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物:5′-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3′；人IFN-γ上游引物：5′-TGTAGCGGATAATGGAAC-3′，下游引物：5′-ATGTATTGCTTTGCGTTG-3′；人IL-4上游引物：CCCTCTGTTCTTCCTGCTA-3′，下游引物：5′-TCTGGTTGGCTT-CCTTCA-3′。PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 5 μl、上游引物1.5 μl、下游引物1.5 μl、dNTPs 2 μl、Taq酶 0.5 μl、ddH2O水 37.5 μl、cDNA模板2 μl，總體積 50 μl。擴增條件為95℃ 5 min；95℃ 30s，55℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，35個循環(huán)；72℃ 7 min終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(100 V,70 min) 檢測。

2結(jié)果

2.1活動期RA患者iNKT細胞頻率及流式分選結(jié)果實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活動期RA患者iNKT細胞頻率為(0.12±0.07)%，體外擴增后，iNKT細胞頻率增長到(0.97±0.13)%；采用磁珠法分離純化后，iNKT細胞純度達90%以上(圖1)。

2.2CH1b對 RA病人iNKT細胞增殖的影響實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)后對照組的iNKT細胞增殖率為(28.33±3.17)%。與對照組相比，CH1b組細胞的增殖率增加了(7.23±1.14)%，差異顯著(P<0.05)；與α-Galcer組相比CH1b組細胞增殖率增加了(6.17±1.03)%,差異顯著(P<0.05)(圖2)。

2.3CH1b對RA病人iNKT細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4的影響與對照組相比，α-Galcer組IFN-γ和IL-4水平分別增加了(60.14±7.36)%、(44.42±5.13)%，差異顯著(P<0.05)；CH1b組IFN-γ和IL-4的分泌量分別增加了(19.73±3.25)%、(144.4±9.77)%，差異顯著(P<0.05)。對照組IFN-γ/IL-4為2.8±1.3，α-Galcer組為3.2±1.7，CH1b組為1.27±0.56,組間比較，差異顯著(P<0.05)(圖3)。

2.4CH1b對RA病人iNKT細胞IFN-γ和IL-4 mRNA表達的影響與對照組相比，α-Galcer組IFN-γ mRNA表達與IL-4 mRNA表達均明顯增高；CH1b組IFN-γ mRNA表達差異不明顯，IL-4 mRNA的表達明顯增高(圖4)。

3討論

iNKT細胞是一類識別由CD1d提呈的糖脂類抗原的固有型免疫細胞,活化后迅速釋放大量細胞因子調(diào)控免疫細胞分化，直接或間接參與機體免疫應(yīng)答，在抗感染、抗腫瘤及自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。近年研究結(jié)果表明，iNKT參與RA發(fā)病，并在疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[12，13]。

我們前期研究結(jié)果顯示：與健康人相比，活動期RA患者外周血中iNKT細胞頻率明顯降低，病情緩解后iNKT細胞頻率可恢復(fù)至接近正常水平。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上進一步觀察了含噻唑烷酮的糖類衍生小分子CH1b對活動期RA患者的iNKT細胞的影響。結(jié)果顯示：與對照組和α-Galcer組相比，CH1b組iNKT細胞增殖率明顯增加，說明CH1b能促進IL-2引起的iNKT細胞增殖，提示CH1b能促進活化后的iNKT細胞增殖。

iNKT細胞活化后能夠迅速釋放大量Th1、Th2代表性細胞因子(IFN-γ、IL-4)和其他細胞因子，調(diào)控免疫細胞分化方向，發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。iNKT細胞既可以分泌IFN-γ誘導(dǎo)Th0向Th1分化、激活免疫細胞的殺傷活性而促進細胞免疫應(yīng)答，也可以分泌IL-4誘導(dǎo)Th0向Th2分化，促進B淋巴細胞活化增殖，提升體液免疫應(yīng)答。iNKT細胞活化后引起的免疫反應(yīng)極具多向性，因此IFN-γ/IL-4比值能夠作為反映iNKT細胞分泌細胞因子傾向性的良好指標(biāo)[10]。實驗結(jié)果顯示：α-Galcer能促進iNKT細胞IL-4和IFN-γ的分泌，IFN-γ/IL-4顯著提高；CH1b能顯著性促進IL-4的分泌，而對IFN-γ分泌的影響不明顯，IFN-γ/IL-4顯著降低。說明α-Galcer刺激iNKT細胞分泌細胞因子具有明顯Th1傾向，能誘導(dǎo)Th0向Th1方向分化；而CH1b刺激iNKT細胞分泌細胞因子具有明顯Th2傾向，能誘導(dǎo)Th0向Th2方向分化。提示了CH1b對iNKT細胞因子分泌的影響對于糾正RA患者Th1/Th2平衡紊亂可發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

我們通過進一步檢測各組iNKT細胞中IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA表達，從分子水平上驗證了上述結(jié)論。與對照組相比，CH1b組IL-4 mRNA的表達明顯增高。提示CH1b主要通過上調(diào)IL-4 mRNA的表達影響iNKT細胞免疫調(diào)節(jié)功能，對改善活動期RA的Th1極化而Th2抑制的狀態(tài)具有重要意義。

綜上所述，CH1b能夠促進IL-2活化的iNKT細胞體外增殖；增加iNKT細胞IL-4分泌、降低IFN-γ/IL-4；表明CH1b具有促進iNKT細胞增殖活性、增強iNKT細胞免疫調(diào)節(jié)功能和下調(diào)疾病炎性指標(biāo)的潛質(zhì)，可能在抗腫瘤、抗感染和治療自身免疫性疾病中具有重要作用。但iNKT細胞對免疫調(diào)節(jié)劑CH1b的識別方式及CH1b作用于iNKT細胞關(guān)鍵機制有待于進一步更深入的研究。

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[收稿2015-05-12修回2015-07-07]

(編輯倪鵬)

Effcets on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b

MENGMing,ZHANGXue-Jiao,WENGPei-Shan,XUMing-Hua,CHENDan，HOUMing-Hui,CHENDong-Zhi.SchoolofMedicine,HebeiUniversity,Baoding071000，China

[Abstract]Objective:To investigate effects of a novel synthetic immunostimulator CH1b containing thiazolidin-4-one on the immunoregulation funotion of iNKT(invariant nature killer T) cells in active RA patients in vitro. Methods: Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) isolated from active RA patients were cultured with stimulation of α-Galcer and IL-2 in vitro and iNKT cells were then separated by using magnetic activated cell sorting(MACS)method with iNKT isolation kit.The cells were divided into three groups:control group (IL-2),α-Galcer group (IL-2+α-Galcer),CH1b group(IL-2 +CH1b).The effects of CH1b on the proliferation of iNKT cells in active RA patients were analyzed by using MTT assay.MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit was used to evaluate the secretion of IFN-γ and IL-4 in iNKT cells culture media.The expressions of IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA in iNKT cells were analyzed by RT-PCR. Results: Compared with control and α-Galcer group,the proliferation of iNKT cells of CH1b group were significantly higher(P<0.05).Compared with control,the ratio of IFN-γ/IL-4 in iNKT cells culture media in active RA patients of CH1b group were significantly lower (P<0.05).Compared with control，expressions of IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA were higher in α-Galcer group;compared with control,expressions of IL-4 mRNA were higher in CH1b group,while there were no obvious difference on expressions of IFN-γ mRNA. Conclusion: CH1b was found to significantly stimulate the actived iNKT cells in active RA patients proliferation，promote the secretion of IL-4，and increase the ratio of IFN-γ/IL-4,promote the expression of IL-4 mRNA in iNKT cells in active patients.

[Key words]Rheumatoid arthritis(RA);Invariant nature killer T(iNKT);Immunostimulants;IFN-γ/IL-4

作者簡介：孟明(1964年-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫調(diào)節(jié)與自身免疫病方面研究，E-mail:mengming127@163.com。

通訊作者③，E-mail:chenddzz@163.com。

中圖分類號R392.12R256R979.5
①本文為國家自然科學(xué)基金(NSFC)(81373197)、河北省自然科學(xué)基金(H2014201133，H2015201131)、河北大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新項目(201410075007)。
②河北大學(xué)附屬醫(yī)院，保定071000。

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0218-05