用于腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)的微流控芯片構(gòu)建及培養(yǎng)條件研究

徐為峰，王　帥,2,3，孟憲生,2,3，包永睿,2,3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連　116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 沈陽　110032；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連　116600)

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用于腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)的微流控芯片構(gòu)建及培養(yǎng)條件研究

徐為峰1，王帥1,2,3，孟憲生1,2,3，包永睿1,2,3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 沈陽110032；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連116600)

摘要:目的設(shè)計制作用于腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)的微流控芯片，以海藻酸鈣凝膠為細(xì)胞支架，基于芯片研究適合的凝膠形成、溶解條件，利用該條件長期培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞并檢測其活力。方法利用CDR軟件、軟光刻技術(shù)、模塑法、等離子鍵合法等設(shè)計并制作出微流控芯片并驗證其適用性；在芯片中三維培養(yǎng)肝腫瘤細(xì)胞SMMC-7721，觀察細(xì)胞形態(tài)，以IPP軟件輔助計算細(xì)胞在72h的存活率。結(jié)果設(shè)計制作的微流控芯片適合于腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)；芯片中培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞72 h內(nèi)生長狀態(tài)良好，存活率達(dá)(96.1±4.5)%，細(xì)胞堆積排列緊密，出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞聚集體(tumor cell spheroid, TCS)。結(jié)論該文設(shè)計構(gòu)建用于腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)的微流控芯片，并用于肝癌細(xì)胞SMMC-7721培養(yǎng)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且細(xì)胞生長與聚集狀態(tài)表現(xiàn)出一定特殊性。利用該芯片進(jìn)行腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)，可以為腫瘤細(xì)胞生長狀態(tài)研究及抗腫瘤藥物篩選提供更有利的方式。

關(guān)鍵詞:微流控芯片；腫瘤細(xì)胞；腫瘤微環(huán)境；細(xì)胞三維培養(yǎng)；海藻酸鈣凝膠；培養(yǎng)條件

微流控技術(shù)是興起于近幾十年的一項新技術(shù)，其應(yīng)用于藥理學(xué)研究最大的特點是可以在與人體微環(huán)境相似的條件下進(jìn)行實驗，且具有快速、靈敏、節(jié)約的優(yōu)勢[1-2]。二維細(xì)胞培養(yǎng)是目前使用較為普遍的一種細(xì)胞培養(yǎng)手段,亦廣泛應(yīng)用于體外腫瘤研究模型[3-5]。目前微流控芯片中的細(xì)胞實驗多數(shù)是將PDMS芯片與玻璃層鍵合，將細(xì)胞在玻璃上平面培養(yǎng)，該方法利用了芯片微尺度研究及高效、節(jié)約的優(yōu)勢，但許多研究已經(jīng)證明，平面培養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞無法全面反映細(xì)胞在人體內(nèi)的生長狀態(tài)，Keiran等[6]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞在二維與三維條件下RNA水平已出現(xiàn)數(shù)百個片段的差異。張旭朗等[7]通過構(gòu)建體外微囊化腫瘤細(xì)胞三維模型研究發(fā)現(xiàn)，抗癌藥物對微囊化乳腺癌細(xì)胞球的抑制率降低。劉勁松[8]的實驗表明，三維培養(yǎng)的肝腫瘤細(xì)胞纖維蛋白骨架發(fā)生重排，結(jié)構(gòu)與在體肝組織更接近。此外，三維培養(yǎng)下的細(xì)胞微環(huán)境、細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用能明顯影響分泌、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移等細(xì)胞功能[9]。因此，有必要將微流控技術(shù)與腫瘤細(xì)胞的三維培養(yǎng)結(jié)合，在更接近真實狀態(tài)下進(jìn)行實驗研究。本實驗設(shè)計了一種可以實現(xiàn)細(xì)胞三維培養(yǎng)的芯片結(jié)構(gòu)，以大分子生物多糖海藻酸鈉(C6H7NaO6)x和氯化鈣形成的無毒、透明、生物相容性好、持水能力強(qiáng)的海藻酸鈣凝膠為三維骨架[10-11]，對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721進(jìn)行長期培養(yǎng)。為基于微流控技術(shù)在細(xì)胞水平進(jìn)行的腫瘤藥理學(xué)研究提供了新的模式。

1材料與方法

1.1細(xì)胞懸液的制備人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，購于昆明細(xì)胞庫，以含小牛血清的RPMI 1640高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長狀態(tài)良好，密度大于80%時，以胰蛋白酶消化，培養(yǎng)液吹打，制成細(xì)胞密度為5×108·L-1的懸液備用。

1.2主要儀器與試劑勻膠機(jī)(KW-4A型，昆山力電精密機(jī)械有限公司)；光刻機(jī)(北京中科同志科技有限公司，TG-2U型)；體視顯微鏡(SMZ-745 ,尼康公司)；倒置熒光顯微鏡(ECLIPSE-TI，尼康公司)；等離子鍵合機(jī)(PDC-32G-2;HARRICK PLASMA公司)； LSP04-1A 精密注射泵(保定蘭格公司)；酶標(biāo)儀(SpectraMax384PLUS，美谷分子儀器公司)；圖像處理軟件Image-Pro Plus 6.0(IPP, 美國Media Cybernetics公司)。

海藻酸鈉(Sigma公司，批號:081M1093V)；氯化鈣(Sigma公司，批號：SLBC6574V)；檸檬酸鈉(沈陽市試劑一廠)；熒光素鈉(北京市化工廠，批號：101101，Mr：376.27)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基，胰蛋白酶(Gibco公司)；SU-8光刻膠及顯影液(美國Micro-Chem公司，批號：33540H28)；Sylgard184 型聚二甲基硅氧烷(PDMS，美國DowCorning公司)。染色劑(LIVE/DIED? Viability/Cytotoxicity kit，美國Life-technology公司，批號1724759)

2微流控芯片的設(shè)計和制作

2.1芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計該芯片由閥控層與細(xì)胞通道層組成，包含兩組相互獨立且相同的實驗單元，見Fig 1。細(xì)胞通道層(圖中藍(lán)色)包括3條相同的細(xì)胞通道，每條通道由3個1.3 mm×1.5 mm的橢圓形微培養(yǎng)腔組成，上下兩端為液體入口與出口；每條細(xì)胞通道兩側(cè)各有一條流體通道，流體通道通過若干個弧形微通道與微培養(yǎng)腔相連，其中，通過一側(cè)與一條細(xì)胞通道相連的流體通道寬度為250 μm，通過兩側(cè)與兩條細(xì)胞通道相連的流體通道寬度為500 μm，每條流體通道兩端分別有液體入口與液體出口。流體通道在與連接微通道相連處變窄以保證流體壓力均勻。每個細(xì)胞培養(yǎng)單元的閥控層(圖中紅色)位于微通道上方，為液壓閥，依靠通入液體的壓力導(dǎo)致薄膜形變壓緊下方的微通道，整個微閥聯(lián)動控制。

2.2芯片的制作芯片掩模打印于菲林片上。在高清潔度的硅片上旋涂SU-8光刻膠，高度約600 μm。按文獻(xiàn)[12-13]制得芯片。將PDMS與潔凈的玻璃片在等離子清洗機(jī)中以720 V, 25 mA, 18 W的參數(shù)處理3 min，取出貼合，以體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇和去離子水分別沖洗通道，烘干，即完成芯片的制作，見Fig 2。

2.3主要溶液的配制稱取海藻酸鈉(C6H7NaO6)x粉末，緩慢攪拌使海藻酸鈉充分溶解，配制成質(zhì)量濃度為10 g·L-1的溶液。分別稱取不同質(zhì)量的無水氯化鈣(CaCl2)與檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2 H2O)，以三蒸水為溶劑，分別配制成質(zhì)量濃度為10 g·L-1的氯化鈣溶液和質(zhì)量濃度為100 g·L-1的檸檬酸鈉溶液。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃保存待用。

3芯片內(nèi)成膠與溶膠效果考查

3.1芯片內(nèi)成膠條件考查將含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 g·L-1熒光素鈉的海藻酸鈉溶液在“2.1”中的芯片微閥加壓關(guān)閉的狀態(tài)下，自各細(xì)胞注入口緩緩注入并充滿微培養(yǎng)腔內(nèi)，隨后打開微閥，以玻璃堵頭封住細(xì)胞培養(yǎng)通道兩側(cè)流體通道的排液口，自對應(yīng)的進(jìn)樣口通入氯化鈣溶液，使Ca2+經(jīng)微通道滲入微培養(yǎng)腔內(nèi)，作用15 min，與海藻酸鈉發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)生成海藻酸鈣凝膠，于熒光顯微鏡下觀察熒光分布是否均勻。

換將不含熒光素鈉的不同濃度海藻酸鈉溶液同上操作至“兩側(cè)流體通道的排液口”后，自流體入口通入含有0.1 g·L-1熒光素鈉的氯化鈣溶液，以同上方式生成凝膠。隨后持續(xù)以培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞腔兩側(cè)的微流體通道，除去多余的Ca2+，置倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)合圖像分析軟件IPP，分析微培養(yǎng)腔中凝膠膠體所含熒光素鈉被培養(yǎng)液清洗的情況，判斷海藻酸鈣凝膠中的液體完成一次全更新的速度，即形成凝膠的通透性。通過微量注射泵，自兩側(cè)的液體入口向形成的海藻酸鈣凝膠中持續(xù)通入培養(yǎng)液，在37℃，5% CO2中放置3 d以上，每日觀察凝膠的性狀。

3.2芯片內(nèi)溶膠效果考查在微閥加壓關(guān)閉的狀態(tài)下，自與細(xì)胞腔相連的進(jìn)樣口向腔內(nèi)持續(xù)以不同流速通入檸檬酸鈉溶液，作用10 min，于細(xì)胞腔出口處收集流出液，鏡下觀察在規(guī)定時間內(nèi)海藻酸鈣凝膠完全溶解并自芯片內(nèi)流出的效果。

3.3微流控三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片中肝癌細(xì)胞生長狀態(tài)的考查將“1.1”中密度為5×108·L-1的細(xì)胞懸液與等體積的海藻酸鈉溶液均勻混合，使細(xì)胞密度為2.5×108·L-1。按照“3.1”中的條件及方法形成凝膠。由與培養(yǎng)腔相連的進(jìn)液口向芯片細(xì)胞培養(yǎng)腔室中以0.1 mL·L-1的流速通入含體積分?jǐn)?shù)為10% CS的RPMI 1640培養(yǎng)液長期培養(yǎng)。每日拍照觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，比較增殖速度，記錄3 d。3 d后以細(xì)胞活性檢測試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，試劑盒由鈣黃綠素-AM和乙錠二聚體-1組成。將鈣黃綠素-AM 5 μL和乙錠二聚體-1 10 μL溶于PBS 1 mL中，混合均勻后自進(jìn)液口通入到芯片中[14]，室溫避光染色30 min后，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。細(xì)胞存活率按公式計算：細(xì)胞存活率/%=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%[15]。

4結(jié)果

4.1芯片適用性分析對芯片流體通道中流體的灌注以及液壓微閥對通道的壓緊效果進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，液閥未加壓的時候，自流體通道注入的液體會均勻充滿整個通道；液閥壓緊流體通道與細(xì)胞通道間的微通道時，自流體通道入口注入的流體只經(jīng)過流體通道而不進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)腔，而自細(xì)胞進(jìn)樣口注入的液體在充滿微培養(yǎng)腔后由細(xì)胞通道的液體出口流出，不進(jìn)入流體通道(Fig 3)。液閥靈敏度高，響應(yīng)速度快，對流體通道壓緊作用明顯。

A: The micro-valve close the microchannel when pressure is given(40×);B: Liquids in the micro-chamber wouldn′t diffuse into the microchannel when pressure is given to the micro-valve(40×);C: Liquids in the micro-chamber diffuse into the microchannel when the pressure in micro-valve is removed(40×)

4.2芯片內(nèi)成膠效果按篩選出的條件進(jìn)行芯片內(nèi)成膠實驗，發(fā)現(xiàn)在實驗條件下，利用該微流控芯片，10 g·L-1的海藻酸鈉溶液pH在7.2～7.5之間。自該芯片上的流體通道注入10 g·L-1的氯化鈣溶液，在規(guī)定流速下，Ca2+可均勻、緩慢滲入海藻酸鈉溶液內(nèi)部并與其生成凝膠，凝膠均勻充滿腔體(Fig 4)，膠體含水量大，具有一定強(qiáng)度，具有較好通透性，在細(xì)胞培養(yǎng)條件下放置3 d保持穩(wěn)定。

微培養(yǎng)腔內(nèi)凝膠形成后，按照“3.1”所述，壓緊微閥，自細(xì)胞注入口向微通道內(nèi)以0.1 μL·min-1的流速通入培養(yǎng)液作用不同時間，置倒置熒光顯微鏡下觀察膠體中熒光素鈉被培養(yǎng)液清洗的情況，利用IPP軟件分析熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示，通入培養(yǎng)液60 s后，微培養(yǎng)腔內(nèi)的熒光強(qiáng)度降低為初始強(qiáng)度的2%以下(Fig 5)。

4.3芯片內(nèi)溶膠效果按照“3.2”中所述，自細(xì)胞培養(yǎng)腔入口以不同流速通入質(zhì)量濃度為100 g·L-1的檸檬酸鈉溶液10 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流速過大時，檸檬酸鈉溶液無法及時溶解海藻酸鈣凝膠，造成芯片通道內(nèi)壓力過大；當(dāng)流速過小時，海藻酸鈣凝膠無法在10 min內(nèi)被完全溶解。經(jīng)篩選得到5 μL·min-1的流速下，10 min可將微培養(yǎng)腔內(nèi)的凝膠完全溶解并全部自培養(yǎng)腔出口流出。

4.4芯片內(nèi)肝癌細(xì)胞生長狀態(tài)按照“3.3”中的方法培養(yǎng)細(xì)胞并染色拍照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，培養(yǎng)腔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量逐漸上升，以細(xì)胞活性檢測試劑盒染色后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力良好，見Fig 6；細(xì)胞形態(tài)呈類球形，偶見長梭型，常見多個細(xì)胞密集堆疊而成的腫瘤細(xì)胞球樣聚集體，鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在腔內(nèi)分布高度位置不同，見Fig 7。通過 IPP 軟件輔助對細(xì)胞圖像進(jìn)行計數(shù)分析，培養(yǎng)3 d后細(xì)胞存活率為(96.1±4.5)%。

A: 24 h; B: 72 h(bright field);C: 72 h(fluorescence field)

5討論

5.1芯片結(jié)構(gòu)本實驗設(shè)計制作了用于腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)的微流控芯片，選取具有良好生物相容性，無毒、透明、穩(wěn)定的大分子生物多糖海藻酸鈉與二價鈣離子螯合生成的海藻酸鈣作為骨架結(jié)構(gòu)。在構(gòu)建該芯片過程中發(fā)現(xiàn)，首要解決的問題是在微尺度液體層流狀態(tài)下，Ca2+溶液如何均勻、緩慢與微培養(yǎng)腔中的海藻酸鈉相接觸，而不發(fā)生Ca2+溶液在與海藻酸鈉接觸后將海藻酸鈉“推”出通道。為解決該問題，設(shè)計了Fig 1所示的芯片結(jié)構(gòu)。Ca2+溶液由微培養(yǎng)腔兩側(cè)通道加壓滲入微培養(yǎng)腔，與海藻酸鈉螯合而成膠。海藻酸鈉Ca2+形成凝膠后，會發(fā)生一定程度的皺縮，產(chǎn)生一定的空隙；此外海藻酸鈣凝膠具有一定的強(qiáng)度，故可以自與細(xì)胞培養(yǎng)腔相連的入口以低流速灌注培養(yǎng)液進(jìn)行動態(tài)培養(yǎng)。

5.2成膠、溶膠所需溶液應(yīng)用方式在具體實驗操作過程中，芯片中流體的切換難免涉及軟管、接頭的插拔，此外，即使迅速在保證無菌的條件下完成接頭的更換，凝膠膠體中和芯片微通道內(nèi)殘留的Ca2+徹底排除也需要一定時間，本實驗根據(jù)在使用流速下芯片內(nèi)液體完成一次全更新的時間，提前更換連有培養(yǎng)液的接頭。但此法仍然較為繁瑣，今后擬設(shè)計一種無間斷流體切換結(jié)構(gòu)集成于芯片內(nèi)從而解決該問題。另外該實驗過程中不應(yīng)引入含有能與Ca2+生成沉淀的陰離子，故PBS溶液在本實驗中未使用，而以培養(yǎng)液代替。

5.3統(tǒng)計分析方法使用細(xì)胞活性檢測試劑盒對細(xì)胞染色時，由于染色液需要滲入凝膠后著染細(xì)胞，因此孵育時間較常規(guī)染色略長，以30 min為宜。由于三維生長狀態(tài)下細(xì)胞聚集成球，染色后計數(shù)分析準(zhǔn)確度會受到干擾，本實驗采用不同焦平面多次拍照，合并熒光圖后計數(shù)的方式減小誤差。但在本實驗確定了應(yīng)用該方法條件下細(xì)胞具有較高生存率之后，后續(xù)實驗應(yīng)盡量避免大量使用熒光染色后利用IPP軟件計數(shù)的分析方法，而通過檸檬酸鈉溶膠后使用如流式細(xì)胞術(shù)等更加準(zhǔn)確快捷的方式。

6小結(jié)

腫瘤細(xì)胞微環(huán)境對于腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及其與外周環(huán)境的各種聯(lián)系和物質(zhì)交換均有重大的意義。但常規(guī)使用的細(xì)胞培養(yǎng)皿、多孔板均存在無法模擬腫瘤細(xì)胞生長的三維環(huán)境。通過與能夠在微尺度下模擬體內(nèi)生理狀態(tài)的微流控芯片相結(jié)合，本文設(shè)計構(gòu)建了用于腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)的微流控芯片，并篩選出適合的成膠、溶膠條件。在該條件下培養(yǎng)肝癌細(xì)胞SMMC-7721，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且細(xì)胞生長與聚集形態(tài)與傳統(tǒng)二維培養(yǎng)存在差異。利用該芯片和適合的三維培養(yǎng)條件，可以為在更接近真實人體的環(huán)境下深入研究腫瘤細(xì)胞特性，及抗腫瘤藥物的篩選提供更有利的方式。

(致謝：本實驗完成于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)分析測試中心，感謝王達(dá)、索軼平、樊佳新等參與人員。)

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Microfluidic chip for tumor cell 3D culturing establishment and its cultural conditions

XU Wei-feng1, WANG Shuai1,2,3, MENG Xian-sheng1,2,3, BAO Yong-rui1,2,3

(1.CollegeofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,DalianLiaoning116600,China; 2.LiaoningMulti-ComponentsEngineeringTechnologyResearchCenterofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China;3.LiaoningModernizationResearchandEngineeringLaboratoryofTraditionalChineseMedicine,DalianLiaoning116600,China)

Key words:microfluidic chip; tumor cell;tumor microenvironment;three-dimensional cell culture; sodium alginate; culture condition

Abstract:AimsTo design and fabricate the 3D cell cultural microfluidic chip for tumor cell culturing, with which to research the compatible conditions for gelatin forming and dissolving with calcium alginate as the scaffolds. To culture SMMC-7721 cells in the chip and to detect the surviving rate.MethodsThe microfluidic chip was fabricated with the software Corel Draw, the technology of soft lithography, molding, and plasma bonding. The applicability was tested and cells were cultured on it, on which the cell status was observed, their surviving rate was calculated with the help of the software IPP.ResultsThe chip we fabricate was calculated is suitable for cell 3D culturing, the tumor cells showed a favorable proliferation ability in 72 h on chip, the surviving rate was (96.1±4.5)%. The cells were solid and TCS appeared.ConclusionThe microfluidic chip manufactured appeared for tumor cell 3D culture, is suitable for the growth of SMMC-7721 and the cells are indubitable. They show some different status in proliferative and agminated compared with traditional 2D cell culture. With the chip and the condition found, there will be a better way to study the characteristics of tumor cells and is beneficial to the screen of anti-tumor drugs.

收稿日期:2015-12-26,修回日期:2016-02-18

基金項目：國家“十二五”重大新藥創(chuàng)制專項(No 2013ZX09507005-005)

作者簡介：徐為峰(1990-),男，碩士生，研究方向：藥物分析,E-mail:xuwf0529@163.com; 孟憲生(1964-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥組分配伍、代謝組學(xué)及藥品質(zhì)量分析，通訊作者,E-mail:mxsvvv@126.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.027

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0581-05

中國圖書分類號：R329.24；R34-33；R73-3；R735.7

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.054.html

◇實驗方法學(xué)◇