兔VX2鼻咽移植瘤模型建立的研究現(xiàn)狀

胡 月，文慶蓮，張 莉

（1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，腫瘤科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，核醫(yī)學科，四川瀘州 646000）

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綜述與專論

兔VX2鼻咽移植瘤模型建立的研究現(xiàn)狀

胡 月1，文慶蓮1，張 莉2

（1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，腫瘤科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，核醫(yī)學科，四川瀘州 646000）

【摘要】總結(jié)和介紹了兔VX2鼻咽移植瘤模型的制作方法，并對模型制備的各個環(huán)節(jié)進行了分析和方法改進的探討，以期為醫(yī)學實驗研究提供良好的動物模型。

【關(guān)鍵詞】兔；VX2；鼻咽腫瘤；模型，動物

鼻咽癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居耳鼻喉科惡性腫瘤之首，而鼻咽腫物由于其解剖位置深在，周圍毗鄰結(jié)構(gòu)復雜而重要，不易進行直觀的在體觀察或活體取樣研究，此時體內(nèi)實驗就顯得尤為重要。體內(nèi)實驗之中的動物實驗，即利用動物對人類疾病進行復制，既可以縮短疾病的自然病程，便于觀察疾病發(fā)生發(fā)展的全過程，又能進行活體解剖，從病理層面對鼻咽癌加以研究，使得結(jié)果更具有科學依據(jù)與說服力。VX2腫瘤是一種來源于Shop病毒于皮膚誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌，于1940年正式建立株［1］，現(xiàn)已被廣泛用于腫瘤領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究，國內(nèi)外一些學者將VX2腫瘤種植于耳廓、腦部、肝臟、肺部、腎臟等［2-8］部位，進行腫瘤各方面的研究。但由于鼻咽原位移植瘤的動物模型不多，且在鼻咽移植瘤動物模型的建立上，沒有統(tǒng)一的標準，故本文對兔VX2鼻咽移植瘤模型制作方法的現(xiàn)狀作如下綜述，為后續(xù)鼻咽癌的體內(nèi)研究提供合適的實驗動物模型。

1 鼻咽移植瘤模型建立和應(yīng)用概況

鼻咽癌發(fā)病率逐年遞增，對鼻咽癌的相關(guān)基礎(chǔ)及臨床研究也成為腫瘤領(lǐng)域的熱點。國內(nèi)外許多學者都曾建立過不同的鼻咽癌動物模型，以進行鼻咽腫瘤不同特性的深入研究。黃小鵬等［9］將鼻咽

2 兔VX2鼻咽移植瘤模型制作方法

2.1 動物的選擇

新西蘭兔對VX2腫瘤天然缺乏免疫機制，因而VX2瘤株移植成功率［15］且VX2的頭頸部腫瘤模型在生物學特性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移、侵襲方式上都與人頭頸部腫瘤極為相似［16-18］。人類鼻咽腫瘤大多為鱗癌，其中低分化的鱗狀細胞癌可占85%以上，而VX2瘤株作為一種低分化的鱗狀細胞癌，在病理學上與其共通，有利于鼻咽腫瘤的病因?qū)W、血清學等方面的研究［19］。而隨著VX2腫瘤細胞在體內(nèi)的迅速生長，逐漸向周圍組織浸潤，尤以咽旁間隙、鼻腔、口咽居多，斜坡、海綿竇、顱底等也有侵及，這與人鼻咽腫瘤的生長特性十分相似［20］，可以此進行鼻咽腫瘤診斷、治療等方面的探討。在遠處轉(zhuǎn)移方面，種植于頭頸部的VX2腫瘤同人類鼻咽腫瘤一樣，都會進一步進展，侵犯淋巴結(jié)，首先波及同側(cè)頸深淋巴結(jié)，腫瘤種植成功一定時間后，其同側(cè)頸深淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率可達到100%［21］，并逐漸轉(zhuǎn)移至同側(cè)頸淺淋巴結(jié)，進而擴散至對側(cè)頸部淋巴結(jié)，晚期甚至發(fā)生肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移。因此利用VX2鼻咽移植瘤模擬人類鼻咽腫瘤的在體生長，具有較強的實驗可行性。同時，兔的鼻咽部接近于人的解剖學形態(tài)，鼻咽部結(jié)構(gòu)易進行影像學觀察，進行影像學引導下的穿刺接種。因此選擇新西蘭白兔（II級動物）建立模型，雌雄不限，月齡多選擇3～4月齡的新西蘭兔，此時兔的生理機能穩(wěn)定，生長發(fā)育良好，易于進行長時間的飼養(yǎng)及觀察［22，23］，體重在2.5 kg ～2.6 kg左右。

2.2 動物的麻醉

家兔體型中等，且此次操作持續(xù)時間短，需選擇安全系數(shù)高，麻醉效果好，不良反應(yīng)少的麻醉方式及藥物。復合麻醉能夠減少單種藥物在動物體內(nèi)的蓄積量，減低麻醉風險，是合適的麻醉方式。速眠新在麻醉誘導階段具有誘導快、安全性好、效果穩(wěn)定等優(yōu)勢，是良好的麻醉誘導劑［24］。高堂成、許達、顏克松等［25-27］先后發(fā)表的文章中闡述了氯胺酮與速眠新復合麻醉在動物實驗中的應(yīng)用，曹春艷、王小銘、張立永等［28-30］也探討了速眠新聯(lián)合水合氯醛、速眠新聯(lián)合地西泮的麻醉方法，其麻醉效果較好、麻醉深度易于控制、手術(shù)需要及動物安全都能得到有效保證，都可作為此次實驗的麻醉藥物。參照有關(guān)文獻［31，32］，氯胺酮與速眠新聯(lián)合方案采用速眠新II注射液0.1 mL/kg及鹽酸氯胺酮注射液0.3 mL/kg～0.5 mL/kg，混勻后在兔大腿外側(cè)肌肉注射，必要時在首次給藥0.5 h后追加首次用量的1/3～1/2。速眠新聯(lián)合水合氯醛方案采用速眠新II注射液0.1 mL/kg～0.2 mL/kg肌內(nèi)注射麻醉，當兔對刺激反應(yīng)遲鈍時，再沿耳緣靜脈緩慢推注10%水合氯醛1 mL/kg～1.5 mL/kg。速眠新聯(lián)合地西泮方案采用速眠新II注射液0.2 mL/kg～0.3 mL/kg，地西泮0.2 mL/kg分別臀部肌肉注射。

2.3 接種液的選擇

細胞接種法和組織塊接種法是目前構(gòu)建移植瘤動物模型的兩種主要方法。其中細胞接種法分為細胞懸液接種法和細胞勻漿接種法，組織塊接種法分為新鮮組織塊接種法、凍存組織塊接種法以及組織塊包埋法。組織塊包埋法一般適用于皮下移植瘤的構(gòu)建，由于鼻咽部位于頭顱中央，無法活體解剖出鼻咽部進行瘤塊的包埋，因此以下主要介紹其余幾種方法在構(gòu)建兔VX2鼻咽移植瘤中的應(yīng)用。

蔡豐等［33］采用細胞懸液接種法建立了模型，將對數(shù)生長期的腫瘤細胞進行消化，加入適量生理鹽水后，制成所需濃度的細胞懸液。此接種法形成的瘤塊大小形狀較均勻，減小了腫瘤外觀體積差異帶來的實驗誤差。但其瘤塊生長時間較長，對有較短時間限制的實驗不宜選用。

王曉東等［34］采用細胞勻漿接種法構(gòu)建模型，從傳代新西蘭兔身上取出并選用有活力的腫瘤組織，將其盡量剪碎呈勻漿狀，置于200目無菌不銹鋼濾網(wǎng)上研磨，在過濾后的底層細胞勻漿內(nèi)加入適量生理鹽水，制成所需濃度的細胞勻漿。細胞勻漿的制備需要反復在濾網(wǎng)上研磨，以確保過濾成單細胞懸液，但研磨時間過長、研磨力度過大，都極易造成腫瘤細胞的失活壞死，因此模型制作的成功率較低。

而吳媛等［35］采用新鮮組織塊接種法建立模型，選用出適宜的腫瘤組織后，將其盡量剪碎，使得腫瘤組織碎塊小于1 mm3，再用生理鹽水調(diào)整為所需濃度的組織懸液。

凍存組織塊接種法則需先將凍存于-70℃液氮中的組織利用組織塊復蘇法復蘇，再采用新鮮組織塊接種法的步驟制作組織懸液。文慶蓮等［36］研究者認為，造模成功率最高的是新鮮組織塊種植法，但其與凍存組織塊種植法都存在所形成腫瘤體積差異大的問題，且這兩種懸液注射過程中容易造成針頭的堵塞，影響模型的制作。

在實際操作的過程中，需要充分綜合考慮腫瘤組織及實驗兔狀態(tài)、操作用具規(guī)格以及實驗人員技術(shù)水平等具體情況，選擇適宜的接種液類型。

2.4 種植部位

兔鼻咽部解剖學形態(tài)與人相似又略有不同，根據(jù)其硬腭及鼻中隔短，而軟腭較長的特點，界定其鼻咽部范圍為：前界為上頜結(jié)節(jié)與垂體窩后緣的聯(lián)線，頂部為基蝶骨（蝶骨體）與基枕骨（枕骨底部），底部為軟腭，兩側(cè)壁為粘膜和軟組織，沿軟腭作一延線迄咽后壁為后界［37］。

2.5 腫瘤接種

懸液的穿刺接種目前可采用經(jīng)軟腭穿刺接種法與經(jīng)舌骨中點穿刺接種法。

經(jīng)軟腭穿刺接種法：實驗兔麻醉后，將四肢與頭部固定，呈仰臥位，嘴部呈張口固定，一只手固定舌與下顎，暴露軟腭，另一只手由牙齒向懸雍垂方向輕按硬腭，當感覺到與硬腭明顯不一樣的柔軟感，即到達軟腭，持19 G穿刺針穿過軟腭達鼻咽部，直至穿刺針遇到阻力，提示針尖已達鼻咽頂后壁，停止進針。用注射器抽取約0.5 mL配置好的腫瘤細胞懸液或組織懸液，連接注射器與穿刺針，向接種部位緩慢注入懸液，完成穿刺。

經(jīng)舌骨中點穿刺接種法：實驗兔麻醉后，將四肢與頭部固定，呈仰臥位，對擬穿刺區(qū)域進行剪毛及常規(guī)消毒。首先對兔進行鼻咽部多層螺旋CT平掃，以正中矢狀位作為擬穿刺平面，以舌骨中點后緣作為最佳穿刺點，利用MPR后處理技術(shù)進行觀察和測量，以確定穿刺的角度及距離。持19 G穿刺針按照測量確定的角度和距離，從穿刺點進針，直至穿刺針遇到阻力，提示針尖已達鼻咽頂后壁，停止進針，再次進行多層螺旋CT平掃，觀察此時針尖所在位置，若穿刺位置不滿意，再根據(jù)掃描結(jié)果做適度的調(diào)整甚至重新穿刺，以至針尖位于緊鄰斜坡的鼻咽頂后壁。達滿意位置后，用注射器抽取約0.5 mL配置好的腫瘤細胞懸液或組織懸液，連接注射器與穿刺針，向接種部位緩慢注入懸液，完成穿刺。

金觀橋［38］、張?。?5］以及孟漢卿等［39］研究者選用的穿刺點為舌骨中點，VX2移植瘤成功率分別為為80%（20/25，1只意外死亡，4只未見腫瘤生長）、66.7%（8/12，8只未見腫瘤生長）和80%（20/25，2只穿刺死亡，3只未見腫瘤生長）。黃江瓊等［20］研究者則選擇軟腭作為穿刺點，VX2移植瘤成功率為90.2%（37/41，4只腹瀉死亡，3只未見腫瘤生長）。

兩種穿刺方法亦各有其優(yōu)劣，經(jīng)舌骨中點穿刺接種法由于是在CT引導下穿刺接種，接種部位得到可靠驗證，提高了接種成功率。但反復的CT掃描延長了操作時間，實驗兔易在中途蘇醒，影響接種過程。同時，以舌骨中點后緣作為穿刺點，在進針過程中易誤穿大血管，造成實驗兔失血死亡。經(jīng)軟腭穿刺接種法僅憑實驗人員經(jīng)驗確定穿刺針到達部位，對實驗人員的操作經(jīng)驗及操作能力要求較高，且不能保證穿刺部位的準確性，但顯著縮短了實驗時間，減少了實驗的人力與財力，降低了意外死亡率。在實際穿刺過程中，需根據(jù)具體的操作條件與操作水平，來選擇最佳的接種方式。

2.6 觀察和評價方法

觀察方法：從接種完成后的第1周開始，每一周對實驗兔行CT掃描，掃描范圍包括整個頭顱至環(huán)甲膜，層厚＜3.0 mm。

評價依據(jù)：（1）鼻咽部有軟組織腫塊，或于局部發(fā)現(xiàn)小的軟組織隆起；（2）鼻咽腔不對稱；（3）顱底骨質(zhì)有破壞；（4）頸動脈鞘周圍有一個或多個腫大淋巴結(jié)。于CT圖像上見到以上一個或多個表現(xiàn)，即表明兔VX2移植瘤模型制作成功。

3 方法改進

本文總結(jié)介紹了兔VX2鼻咽移植瘤模型的構(gòu)建方法，并比較了其優(yōu)劣及適用條件。在具體操作中，為了提高模型建立的成功率及模型質(zhì)量，某些過程可根據(jù)情況進行適當改進：（1）在麻醉操作中，為防止兔子掙扎、頭部擺動，造成麻醉針頭刺破耳緣靜脈，可利用固定器將兔頭固定后再行靜脈注射。注射過程中可先推注麻醉藥物總量的1/2，觀察兔子狀態(tài)的同時，緩慢推入剩下的麻醉藥物，一旦發(fā)現(xiàn)兔進入麻醉狀態(tài)，立即停止麻醉，以防麻醉過深。（2）在制作接種液時，最好選擇體積約為2 cm3的腫瘤，體積過大的腫瘤中心常常出現(xiàn)壞死，影響所得接種液活性。（3）若采用細胞勻漿接種法，操作過程中研磨力度不宜過大，研磨時間不宜過長。（4）為保持細胞活性選擇在冰上或其他低溫容器中進行接種液制作，并保持操作環(huán)境的無菌條件。（5）在行穿刺接種時，用固定器將實驗兔頭部固定，確保穿刺位置的準確性。

兔VX2鼻咽移植瘤模型能較大程度還原人類鼻咽腫瘤的在體生長，且模型制作成功率高、適用性廣、可重復性好，對于人類鼻咽腫瘤的診斷、治療、監(jiān)控等各方面研究都有著重要意義。

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〔修回日期〕2016-03-28

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）06-0083-05

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.015

［基金項目］PET-CT在鼻咽癌放療中的基礎(chǔ)和臨床研究（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院［2013］60號）。

［作者簡介］胡月（1991-），女，主要研究方向：腫瘤綜合治療，E-mail：hy_meilin@163.com。

［通訊作者］文慶蓮，女（1973-），教授，主要研究方向：腫瘤綜合治療。E-mail：wql7315@163.com。癌細胞株CNE-2于BALB/c-nu裸鼠四肢皮下建立了移植瘤模型，并采用綠色熒光蛋白（GFP）標記，進行放射抗拒性的研究。而寧喜等［10］將CNE-2鼻咽癌裸鼠模型給予生理鹽水、EGCG、放療、EGCG聯(lián)合放療等不同處理，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合放療組能夠顯著抑制腫瘤生長，得出EGCG能夠增強模型對放療的敏感性，其機制可能與抑制survivin和VEGF的表達水平有關(guān)。張心麗等［11］實驗研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇、順鉑都能顯著的阻遏裸鼠人鼻咽癌CNE-1的生長，對于鼻咽癌，這兩者都是可應(yīng)用于化療中的藥物。但以上鼻咽癌模型都是在小鼠四肢皮下建立，與臨床患者鼻咽癌生長部位差異顯著，其侵襲轉(zhuǎn)移性，生理學、生物學特性也會較之有明顯不同，從而影響實驗觀測結(jié)果。李萍等［12］采用了雞胚材料，利用5-8F鼻咽癌細胞株建立了鼻咽癌雞胚絨毛尿囊膜模型，并在此模型基礎(chǔ)上進行了鼻咽癌細胞侵襲行為研究等。雞胚材料目前已在醫(yī)學研究中廣泛應(yīng)用，但其作為一胚胎性結(jié)構(gòu)，還未形成成熟的周圍組織，這就極大限制了鼻咽癌雞胚絨毛尿囊膜模型的研究范圍，適用性較窄。藍柯等［13］人應(yīng)用DNA重組以及顯微注射等技術(shù)，構(gòu)建出N-M1P1轉(zhuǎn)基因鼻咽癌小鼠模型，研究結(jié)果顯示N-M1P1能夠于小鼠的鼻咽部誘導發(fā)生癌前病變。轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)了外源基因的引入與流動，從基因?qū)用嫜芯考膊〉陌l(fā)生發(fā)展，但轉(zhuǎn)基因動物模型的構(gòu)建難度大，技術(shù)支持要求高，資金耗費大，不適宜進行大規(guī)模的動物模型研究。以上學者都是在小鼠身上建立動物模型，但小動物鼻咽部結(jié)構(gòu)太小，在建立鼻咽癌移植瘤模型時，難以辨認鼻咽部的結(jié)構(gòu)，不能正確判斷腫瘤是否種植在鼻咽部，降低了實驗結(jié)果的可信度。同時，鄭文宏等［14］學者也發(fā)現(xiàn)，人與小鼠胚胎在鼻咽的解剖學和組織學方面都存在著明顯差異，并不是建立鼻咽移植瘤模型的最佳實驗動物。兔體型較大，生物學及轉(zhuǎn)移特性等都與人類相似，便于復制人類鼻咽癌模型并進行后續(xù)的研究。

Current status of establishment ways of rabbit models of VX2 nasopharyngeal carcinoma

HU Yue1，WEN Qing-lian1，ZHANG Li2
（1.Department of Oncology，2.Department of Nuclear Medicine，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou Sichuan 646000，China）

【Abstract】To summarize and introduce the available methods of establishing rabbit models of VX2 nasopharyngeal carcinoma（NPC），and to explore the improvements at each stage in the preparation of the rabbit models，in order to provide a favorable animal model for future experimental research.

【Key words】Rabbit；VX2 tumor；Nasopharyngeal neoplasms；Model，animal