中藥益心康修復感染柯薩奇B3病毒大鼠心肌細胞損傷的實驗研究

聶品晶，陳蘇寧

中藥益心康修復感染柯薩奇B3病毒大鼠心肌細胞損傷的實驗研究

聶品晶，陳蘇寧*

[摘要]目的觀察中藥益心康對感染柯薩奇B3病毒大鼠心肌細胞損傷的修復作用，探討其作用機制。方法將中藥益心康提取液作用于感染柯薩奇B3病毒的大鼠心肌細胞，觀察心肌細胞的細胞病變情況、心肌細胞存活率及心肌酶學水平的變化。結果益心康組、利巴韋林組的細胞病變率低于病毒對照組，益心康組細胞病變率低于利巴韋林組。細胞對照組、益心康組、利巴韋林組的細胞存活率高于病毒對照組(P<0.05)，益心康組細胞存活率高于利巴韋林組(P<0.05)。細胞對照組、益心康組、利巴韋林組的細胞肌酸激酶、肌鈣蛋白Ⅰ低于病毒對照組(P<0.05)，益心康組肌酸激酶、肌鈣蛋白Ⅰ低于利巴韋林組(P<0.05)。結論中藥益心康具有修復感染柯薩奇B3病毒大鼠心肌細胞損傷的作用。

[關鍵詞]益心康；柯薩奇病毒B3；心肌細胞；細胞病變；MTT；CK；cTnI

[Abstract]ObjectiveTo observe the repairment effect of yixinkang on the rats′ cardiomyocytes infected by CVB3virus.MethodsYixinkang was used on rats′ cardiomyocytes which were infected by CVB3virus,the morphological changes and CPE of the rats were observed,and the survival rate of cardiomyocytes,the CK and cTnI were detected by ELISA methods.ResultsThe CPE in cell control group,yixinkang group and ribavirin group were lighter than those of virus control group (P<0.05).The CPE of yixinkang group was lighter than that of ribavirin group (P<0.05).The cell survival rates in cell control group,yixinkang group and ribavirin group were higher than those of virus control group (P<0.05),and the rate of yixinkang group was higher than that of ribavirin group (P<0.05).The levels of CK and cTnI in cell control group,yixinkang group and ribavirin group were lower than those of virus control group (P<0.05),and the levels in yixinkang group were lower than those of ribavirin group (P<0.05).ConclusionYixinkang has repairment effect on the injury of cardiomyocytes infected by CVB3.

收稿日期：2015-08-24

基金項目：武警部隊后勤科研項目(WJH2012-20)；武警后勤學院院級基礎項目(WHJ2014022)；武警后勤學院科研創(chuàng)新團隊資助項目(WHTD201306)

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512005

Repairment effect of yixinkang on the injury of rats′ cardiomyocytes infected by CVB3virusNIE Pin-jing,CHEN Su-ning*(Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Key words：Yixinkang;Coxsackie virus B3(CVB3);Cardiomyocytes;Cell pathological changes;MTT;CK;cTnI

0引言

病毒性心肌炎(Virus myocarditis，VMC)是指嗜心肌病毒感染引起的以心肌非特異性炎癥為主要病變的心肌疾病，近年來其發(fā)病率有逐年增高的趨勢。致病病毒以柯薩奇B組病毒(Coxsackic virus B，CVB3)最為常見，約占30%~50%。在急性期和亞急性期，病毒在心肌組織中大量復制，導致心肌細胞損傷，也可通過T細胞介導的免疫反應間接引起心肌細胞損傷。臨床表現(xiàn)主要有心悸、胸痛、呼吸困難等，嚴重者甚至暈厥、猝死。西醫(yī)治療方法主要有抗病毒、營養(yǎng)心肌、抗心律失常等，療效不理想[1-2]。中醫(yī)將該病歸入“心悸”、“怔忡”范疇[3]，在歷代典籍中對于該病的治療有諸多記載。筆者根據(jù)祖國醫(yī)學理論，結合多年臨床經(jīng)驗，認為該病正氣不足、邪氣侵心是病機關鍵，治療應以扶正祛邪、清熱解毒、活血通絡為主，因此，筆者應用中藥益心康治療該病，并進行了相關的實驗研究[4-5]。本研究通過原代培養(yǎng)心肌細胞的方法，建立了CVB3病毒體外感染心肌細胞的模型，通過對心肌細胞形態(tài)學變化及細胞病變的觀察，從細胞、分子生物學水平對心肌細胞存活率、肌酸激酶(CK)、心肌肌鈣蛋白(cTnI)進行研究，探討益心康修復感染柯薩奇病毒大鼠心肌細胞損傷的作用機制。

1材料與方法

1.1材料藥物與試劑：益心康(人參、黃芪、金銀花、連翹、板藍根、白術、丹參、甘草)購自遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥局，其提取物由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院中藥制劑實驗室用水提醇沉法提取(流程：取益心康飲片250 g，加水煎煮3次，人參單煎，濾過后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮藥液至100 mL，在恒溫振蕩器上震蕩藥液并緩慢加乙醇，使含醇量達75%，4 ℃靜置冷藏過夜、濾過，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收乙醇至無醇味的浸膏，用蒸餾水稀釋至100 mL，用1 mL EP管分裝，在高速離心機上以15 000 r/min離心10 min，取上清液用除菌濾膜過濾備用[6])。利巴韋林注射液：華北制藥有限公司，規(guī)格：1 mL∶100 mg。DMEM培養(yǎng)基：GIBCO，批號：545189。標準胎牛血清(天津擷洋，生產(chǎn)批號：20100310，規(guī)格100 mL)，四甲基偶氮唑藍(MTT，sigma，規(guī)格：250 mg)。CK、cTnI、ELISA試劑盒：貝基生物，批號：20100210。

動物：出生3 d的SD大鼠乳鼠，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，批號：sky2008-2013。細胞：HeLa細胞由中國醫(yī)科大學中心實驗室提供。病毒：CVB3病毒Nancy株，由遼寧中醫(yī)藥大學兒科病毒室提供。CVB3病毒擴增：取單層貼壁生長的HeLa細胞，加CVB3病毒原液l mL，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)吸附1 h，棄掉病毒液，加8 mL維持液繼續(xù)培養(yǎng)，逐日用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化。細胞形態(tài)變圓，細胞皺縮，細胞脫壁，結聚成團等變化為細胞病變(CPE)，CPE出現(xiàn)75%~100% (+++~++++)時停止細胞培養(yǎng)。反復吹打使細胞完全脫落，反復凍融3次，使細胞充分裂解，釋放出病毒顆粒。3 000 r/min離心15 min，取上清液，以0.22 μm的小濾器過濾，EP管分裝，-80 ℃保存留待進行CVB3病毒毒力滴定[7-8]。

儀器：倒置熒光顯微鏡：德國萊卡LEIT20MIL；生物安全柜：美國 NVAIRE425-400；立式壓力蒸汽滅菌器：SHINVA LMQJ3260；循環(huán)水式真空泵：鄭州長城SHB-Ⅲ；二氧化碳培養(yǎng)箱：美國NVAIRE-4950E；水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇SHA-B；低速離心機：江蘇金壇 800；半自動生化分析儀：德國EPPENDORF。

1.2方法

1.2.1心肌細胞的原代培養(yǎng)在無菌條件下，取出SD大鼠心臟，將心臟用無Ca2+、Mg2+的PBS溶液反復洗滌3次后，剪去心房、大血管等組織。然后將剩余組織剪成0.1 mm3的碎塊。將心肌組織碎塊加入5 mL的0.32%胰蛋白酶溶液中，置于水浴恒溫振蕩器，在37 ℃水浴中消化40 min，待心肌組織碎塊充分消化后加2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，在高速離心機上以1 500 r/min離心15 min，重復2次。吸棄上清液，再加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將細胞沉淀混勻，制成細胞懸液，用200目篩過濾，用血細胞計數(shù)器計數(shù)后，分裝于96孔細胞培養(yǎng)板及50 mL細胞瓶中，培養(yǎng)瓶每瓶接種5×105/mL細胞8 mL；96孔細胞培養(yǎng)板每孔中接種2×105/mL細胞200 μL，放入37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后鏡下觀察到心肌細胞貼壁梭形、三角形，有偽足，形成單層的細胞呈放射狀，呈同步搏動，搏動速率多在60~80次/min。心肌細胞培養(yǎng)成功[9-10]。

1.2.2CVB3病毒半數(shù)組織感染量(TCID50)的測定[6]用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將病毒連續(xù)10倍稀釋成10-1~10-1010個濃度，接種于培養(yǎng)有單層生長的原代心肌細胞的96孔板，每個濃度設4個復孔，另設4個正常對照孔。觀察細胞形態(tài)學變化情況(CPE)，結果表示方法如下：“-”細胞正常，“+”25%細胞產(chǎn)生病變，“++”50%細胞產(chǎn)生病變，“+++”75%細胞產(chǎn)生病變，“++++”100%細胞產(chǎn)生病變。以細胞病變達“++”以上為陽性，以最高稀釋度不再出現(xiàn)CPE時為終點。用Reed-Muench法計算TCID50為10-4.22，本實驗取CVB3病毒稀釋濃度為10-4。

1.2.3中藥益心康提取物及利巴韋林注射液對心肌細胞最大無毒劑量(TCID0)的測定[6]將中藥益心康提取物及利巴韋林注射液用2%胎牛血清的DMEM分別稀釋成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096 12個濃度，加入單層生長的原代心肌細胞的96板中，每組均設8個復孔，另設8個正常心肌細胞對照孔。記錄各孔細胞的CPE情況，不出現(xiàn)CPE的藥物最小稀釋倍數(shù)為益心康提取物及利巴韋林注射液的最大無毒劑量。中藥益心康提取液的最大無毒劑量為含生藥量2.44 mg/mL，稀釋比例為1∶1 024。利巴韋林的最大無毒劑量為6.25 mg/mL，稀釋比例為1/16。

1.2.4感染CVB3病毒大鼠心肌細胞模型的制備及實驗分組取長成單層乳鼠心肌細胞，分成4組：①細胞對照組，②病毒對照組，③益心康組，④利巴韋林組。各組單層細胞中，除細胞對照組外，其余各組加入濃度為100 TCID50CVB3的病毒液(96孔板，0.1 mL/孔，培養(yǎng)瓶4 mL/瓶)。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使病毒和細胞充分接觸1 h后，棄病毒液，用PBS洗滌3遍，向各組細胞中加入藥物：①組、②組中各加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(96孔板，0.2 mL/孔，培養(yǎng)瓶8 mL/瓶)；③組中加入益心康提取液及含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的1∶1混合液(96孔板，0.2 mL/孔，培養(yǎng)瓶8 mL/瓶)，益心康提取液濃度為含生藥量2.44 mg/mL(稀釋比例為1∶1 024)；④組加利巴韋林及含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的1∶1混合液(96孔板，0.2 mL/孔，培養(yǎng)瓶8 mL/瓶)，利巴韋林的濃度為6.25 mg/mL(稀釋比例為1∶16)。

1.2.5心肌細胞CPE情況將各組細胞置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24、48 h在倒置顯微鏡下觀察CPE情況，記錄結果，結果表示方法如下：“-”細胞正常，“+”25%細胞產(chǎn)生病變，“++”50%細胞產(chǎn)生病變，“+++”75%細胞產(chǎn)生病變，“++++”100%細胞產(chǎn)生病變。

1.2.6MTT法測細胞存活率各組細胞培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔中加含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液100 μL、MTT液20 μL，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)4 h，吸棄各孔中的液體，向各培養(yǎng)孔中加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，將96孔板放在振蕩器上振蕩10 min，充分混勻，置于酶標儀上測波長570 nm吸光度(Optical density，OD)值。細胞存活率=(實驗孔OD值/對照孔OD值)×100%。

1.2.7ELISA法測定肌酸激酶和肌鈣蛋白Ⅰ各組細胞培養(yǎng)48 h后，用吸管吹打收集貼壁生長的心肌細胞，用超聲粉碎機粉碎3次，在高速離心機上2 000 r/min離心1 min后收集上清液(每組1.5 mL)，按試劑盒說明書用ELISA法測肌酸激酶和肌鈣蛋白Ⅰ。

1.2.8統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s表示，各組均數(shù)比較采用方差分析及t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組心肌細胞CPE比較見表1。

表1　各組心肌細胞CPE比較

各組細胞培養(yǎng)48 h后，細胞生長情況見圖1~圖4。細胞對照組心肌細胞貼壁生長，細胞生長旺盛，向周圍伸出放射狀突起，心肌細胞呈同步搏動(60~80次/min)，節(jié)律規(guī)整，搏動有力。病毒對照組心肌細胞在接種病毒后24 h，細胞仍搏動但速度較慢，節(jié)律欠規(guī)整，開始出現(xiàn)細胞病變；接種病毒48 h，可見細胞團縮、破碎等細胞病變，基本停止搏動。益心康組、利巴韋林組與病毒對照組比較，病變明顯減輕。益心康組細胞病變輕于利巴韋林組。

圖1　細胞對照組48 h細胞生長情況(×100)

圖2　病毒對照組48 h細胞生長情況(×400)

2.2MTT法測定細胞存活率各組細胞培養(yǎng)48 h后，MTT法檢測各組心肌細胞存活率，結果見表2。由表2可見，細胞對照組、益心康組、利巴韋林組的細胞存活率均高于病毒對照組(P<0.05)。益心康組細胞存活率高于利巴韋林組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2　MTT法檢測各組心肌細胞的存活率(%)

2.3各組CK及cTnI比較干預48 h后，各組CK及cTnI結果見表3。由表3可見，細胞對照組、益心康組、利巴韋林組細胞上清液CK、cTnI均低于病毒對照組(P<0.05)，且益心康組低于利巴韋林組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3　益心康組48 h細胞生長情況(×400)

圖4　利巴韋林組48 h細胞生長情況(×400)

組別CKcTnI細胞對照組70.65±7.42180.12±8.37病毒對照組248.37±19.551595.30±457.37益心康組84.51±13.07466.00±52.03利巴韋林組134.00±13.51599.62±40.03

3討論

中醫(yī)認為，病毒應歸入中醫(yī)病因?qū)W的“六淫”范疇，病毒性心肌炎屬于外感病范疇。如果人體正氣充足，六淫之邪不能侵襲人體。反之，當人體因先天稟賦、飲食、勞逸等因素影響而正氣不足時，易受六淫邪氣的侵襲，導致病毒性心肌炎等外感疾病的發(fā)生。中藥益心康是針對病毒性心肌炎“正氣不足，邪氣侵心”的病機，以扶正祛邪、清熱解毒、活血通絡為治療原則，從《太平惠民和劑局方》四君子湯加減化裁而得，其配伍組成中人參、黃芪扶正益氣固表為主藥，輔以白術健脾，合主藥以補脾而助氣血生化之源，使氣充血旺，扶助正氣。佐以金銀花、連翹、板藍根清熱解毒以祛邪，丹參活血通脈，甘草清熱解毒調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏祛邪扶正、清熱解毒之功，多年來應用于病毒性心肌炎取得了很好的療效。

柯薩奇B3病毒侵襲人體可以直接損傷心肌細胞，或通過免疫機制損傷心肌細胞。病毒性心肌炎在急性期和亞急性期，病毒在心肌組織中大量復制，導致心肌細胞的損傷，也可通過T細胞介導的免疫反應間接引起心肌細胞損傷。病毒感染1~3周內(nèi)，臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、咽痛、腹瀉、全身酸痛等呼吸道和消化道癥狀。感染1~3周后，出現(xiàn)心悸、氣短、心前區(qū)不適或隱痛，重者出現(xiàn)呼吸困難或浮腫等心臟受累的表現(xiàn)。在慢性期，病毒持續(xù)低水平復制，導致心肌細胞纖維化，引起擴張性心肌病。可見心肌損傷在病毒性心肌炎的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，臨床治療病毒性心肌炎也應重視對心肌細胞的保護。本研究中，中藥益心康組心肌細胞CPE情況較病毒對照組和利巴韋林組輕微，細胞存活率高于病毒對照組和利巴韋林組，CK、cTnI低于病毒對照組和利巴韋林組，表明中藥益心康具有明顯的保護受損心肌細胞的作用，進一步驗證本方是治療病毒性心肌炎的有效方劑，為中藥益心康治療病毒性心肌炎提供了新的理論依據(jù)。

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作者單位：1.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津300193;2.武警后勤學院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院，天津300162;3.武警后勤學院附屬醫(yī)院醫(yī)療科，天津300162