干細胞誘導(dǎo)分化為肝樣細胞檢測技術(shù)的研究進展

唐 靜唐 偉謝明均*

（1 四川醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2 游仙區(qū)人民醫(yī)院，四川 綿陽 621004；3 宜賓市第一人民醫(yī)院，四川 宜賓 644000）

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干細胞誘導(dǎo)分化為肝樣細胞檢測技術(shù)的研究進展

唐 靜1唐 偉2謝明均3*

（1 四川醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2 游仙區(qū)人民醫(yī)院，四川 綿陽 621004；3 宜賓市第一人民醫(yī)院，四川 宜賓 644000）

【摘要】用于終末期肝病治療的干細胞療法是基礎(chǔ)及臨床研究的熱點。而對干細胞誘導(dǎo)的肝樣細胞進行肝細胞生物學(xué)功能檢測是干細胞治療的重要步驟。肝樣細胞檢測技術(shù)眾多，需從中選出特異性強、靈敏度高、對細胞或機體影響小、方法簡單易行的檢測技術(shù)。本文通過對干細胞誘導(dǎo)分化的肝樣細胞檢測技術(shù)作一綜述，為后期的實驗提供一定的理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】干細胞；誘導(dǎo)；肝樣細胞；檢測

肝臟在機體中參與消化、代謝、免疫等生理過程。毒素、感染等因素可引起嚴重肝細胞損害，導(dǎo)致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴重障礙，最終發(fā)展至終末期肝病，嚴重威脅人類健康。原位肝移植是終末期肝病的有效治療手段，但供肝緊缺及排斥反應(yīng)限制了它的應(yīng)用。干細胞是一類具有自我復(fù)制和多向分化潛能的細胞群體，在合適的條件下，可分化為具有特征性形態(tài)、特異分子標(biāo)志和特殊功能的成熟細胞，如肝細胞、神經(jīng)細胞、骨骼肌細胞、軟骨細胞、血管內(nèi)皮細胞、肺上皮細胞以及胰島樣細胞等[1]。

如今可通過向培養(yǎng)基中加入可溶性因子，如肝細胞生長因子（HGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）等[2-3]，使干細胞向功能性肝樣細胞分化。這些與細胞因子作用后表達的肝細胞特異性標(biāo)志物可通過多種技術(shù)檢測，而優(yōu)選出特異性強、靈敏度高、對細胞或機體影響小、方法簡單易行的檢測技術(shù)是干細胞治療的重中之重。本文通過對干細胞誘導(dǎo)分化為肝樣細胞的檢測技術(shù)作一綜述，以尋求能高效檢測肝樣細胞的技術(shù)，保證誘導(dǎo)分化的肝樣細胞在合成、代謝功能等方面對原代肝細胞進行替代，使得干細胞治療安全、有效的應(yīng)用于科研及臨床。

1 干細胞誘導(dǎo)分化為肝樣細胞的檢測技術(shù)

1.1 RT-PCR：RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，是指對組織或細胞的的總RNA進行提取，把RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后設(shè)計目的基因引物進行PCR，瓊脂糖電泳并數(shù)碼拍照，分析電泳條帶灰度值，判斷目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對量的變化。Robert E等[4]，Simon等[5]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對干細胞誘導(dǎo)后細胞的AFP、ALB 、CK-18、G6PC、

1.2 Western Blot：Western Blot是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測樣品中的特定蛋白的方法。其采用的是PAGE（聚丙烯酰氨凝膠電泳），經(jīng)PAGE分離的蛋白樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體，固相載體與蛋白質(zhì)以非共價鍵連接，以連接的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與相應(yīng)的特異性抗體結(jié)合，再與酶或同位素標(biāo)記的二抗反應(yīng)，對底物顯色或放射自顯影，通過分析著色的位置和著色深度了解特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況。Huang等[6]應(yīng)用該技術(shù)在臍帶干細胞誘導(dǎo)的肝樣細胞檢測出了與陽性對照一致的相對分子質(zhì)量分別為67000、68000、55500 的ALB、AFP、CYP3A4條帶。

1.3 免疫組織化學(xué)技術(shù)：免疫組織化學(xué)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定細胞內(nèi)抗原的成分（主要是多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究。Zhang等[7]在人胎肝前體細胞誘導(dǎo)的肝樣細胞中檢測到ALB、AFP、AAT的表達，確定待檢測細胞可表達肝細胞特異性基因。

1.4 ELISA：ELISA是酶聯(lián)免疫吸附試驗法的簡稱，其基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。通過洗滌將抗原抗體復(fù)合物與液相中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。Wang等[8]成功應(yīng)用人ELISA定量裝置在人造血干細胞誘導(dǎo)的細胞中檢測出白蛋白的分泌，證實了人造血干細胞可誘導(dǎo)為有功能的肝樣細胞。

1.5 流式細胞術(shù)：流式細胞術(shù)是用流式細胞儀測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術(shù)。如今，流式細胞術(shù)與單克隆抗體結(jié)合，可對細胞內(nèi)抗原進行定性、定量檢測[9]。用合適的固定劑及打孔劑對細胞固定打孔。利用抗原抗體特異性反應(yīng)，將熒光染料（熒光探針）連接于不同的單克隆抗體，當(dāng)細胞被激光器發(fā)射的激光照射后，胞質(zhì)的抗原抗體復(fù)合物上的熒光探針可以發(fā)射出不同光譜的繼發(fā)熒光，這些熒光通過流式細胞儀的識別和分辨，從而實現(xiàn)對細胞內(nèi)抗原的定性、定量檢測。Arefeh等[10]用流式細胞術(shù)檢測到多功能干細胞誘導(dǎo)后細胞內(nèi)白蛋白的合成，且表達白蛋白的細胞量已大于總細胞數(shù)的50%。

1.6 PAS染色檢測糖原合成：PAS染色又稱過碘酸雪夫氏染色，一般用來顯示糖原和其他多糖物質(zhì)。其原理是過碘酸的氧化作用使糖類及有關(guān)物質(zhì)中的1、2-乙二醇基為二醛，醛與Schiff試劑（無色亞硫酸品紅復(fù)合物）結(jié)合，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物而得到定位。Huang等[11]應(yīng)用PAS染法對干細胞誘導(dǎo)后細胞內(nèi)糖原進行檢測，并證實了誘導(dǎo)成功的肝樣細胞具有合成糖原的功能。

1.7 肝細胞極性分布的檢測：細胞極化指細胞依據(jù)其生物功能的需要而產(chǎn)生的方向性和不對稱性，具有極化特性的細胞膜分別面對不同的細胞外環(huán)境，并發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。肝細胞是體內(nèi)具有典型極化特征的細胞。肝細胞膜分為3個區(qū)域：面向肝血竇的基底側(cè)膜、面向毛細膽管的頂膜、連接相鄰肝細胞的側(cè)膜。研究表明，極化肝細胞3個膜區(qū)中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成各不相同，基底側(cè)膜的標(biāo)志性蛋白包括Na依賴?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運多肽（NTCP）、低密度脂蛋白受體（LDLR）、多藥耐藥蛋白1，3，4，6（MDR1，3，4，6）、肝細胞生長因子受體（HGF-R）等；毛細膽管頂膜區(qū)包括多藥耐受蛋白1，3（MDR1，3）、多耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）和膽鹽輸出泵（BSEP）等；側(cè)膜區(qū)有構(gòu)成緊密連接的標(biāo)志性蛋白ZO-1等和構(gòu)成間隙連接的結(jié)構(gòu)蛋白連接素等[12]。趙磊等[13]證實了干細胞誘導(dǎo)后的肝樣細胞表達基底側(cè)膜極化蛋白NTCP、SR-B1和MRP2，表明誘導(dǎo)成功的細胞已具有肝細胞極性。

1.8 尿素的檢測：在氨基酸代謝過程中，有毒的氨在肝臟中經(jīng)過鳥氨酸循環(huán)轉(zhuǎn)變成無毒的尿素排出體外。尿素合成是成熟肝細胞清除血氨的主要途徑。經(jīng)干細胞誘導(dǎo)的細胞若具有合成尿素的功能，則證明誘導(dǎo)的肝樣細胞已具有肝細胞的代謝功能。Zhang等[7]成功地運用生化分析儀在人胚胎肝祖細胞誘導(dǎo)分化的細胞中檢測到尿素的生成，表明誘導(dǎo)后的肝樣細胞已具備代謝氨的功能。Bao等[14]在進行無血清及間充質(zhì)干細胞與大鼠肝細胞球混合培養(yǎng)的實驗時，在培養(yǎng)基中加入重氨（15ND3），培養(yǎng)一段時間后，采用氣相色譜分析/質(zhì)譜分析法檢測到富含氘（D）的重尿素的生成，同時采用尿素測試盒確定氨的清除隨著尿素的生成的增多而減少，該檢測不僅證實了體內(nèi)氨的清除與尿素生成的關(guān)系密切，同時明確了同位素的應(yīng)用更方便尿素的檢測。在我們尚未發(fā)表的研究中也使用這一方法對誘導(dǎo)的肝樣細胞尿素的來源進行檢測。

1.9 構(gòu)建肝細胞特異性表達載體：啟動子作為基因調(diào)控序列的重要組成，在DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的過程中，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相結(jié)合，與眾調(diào)控序列及因子一起作用，實現(xiàn)真核生物基因組織特異性表達。目前研究表明，肝細胞中的ALB、AAT、細胞色素P450等基因所含有的肝臟特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列如啟動子、增強子，可與肝臟富含的轉(zhuǎn)錄因子如HNF1、C/EBP及eH-TF等特異性結(jié)合，刺激基因僅在肝組織中高效轉(zhuǎn)錄[15]。將肝細胞特異性基因的啟動子連接于報告基因的上游，構(gòu)建病毒（如腺病毒、慢病毒等）或非病毒（如質(zhì)粒）載體，轉(zhuǎn)染干細胞，當(dāng)干細胞向肝細胞分化時，啟動子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動子被激活，調(diào)控報告基因的表達，報告基因的活性就間接反應(yīng)了肝細胞特異性基因的表達水平，作為研究肝細胞成熟分化的一個檢測手段。張維玉等[16]成功構(gòu)建pBGLuc-ALB質(zhì)粒，并分別將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肝系細胞與非肝系細胞中，同時檢測培養(yǎng)上清中分泌的熒光素酶活性。結(jié)果顯示熒光素酶活性：肝系細胞 >非肝系細胞，免疫熒光檢測ALB含量與熒光素酶活性一致。該研究組進一步應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒成功構(gòu)建穩(wěn)定表達ALB-GLuc的肝干細胞株，誘導(dǎo)肝干細胞向肝樣細胞分化，隨著誘導(dǎo)時間的延長，細胞培養(yǎng)上清中熒光素酶表達逐漸增高，免疫熒光結(jié)果也顯示ALB的表達越來越強，與熒光素酶活性增高的趨勢一致。

2 總結(jié)與展望

對于肝樣細胞的檢測技術(shù)不必要逐個試驗，可選用安全有效的技術(shù)對肝樣細胞代謝、合成功能等方面進行檢測，證實經(jīng)干細胞成功誘導(dǎo)的肝樣細胞具有肝細胞的特性，使得干細胞治療安全、有效的應(yīng)用于科研及臨床。

我國是肝病大國，乙型肝炎尤其嚴重。此外，隨著經(jīng)濟的發(fā)展、生活水平的提高以及環(huán)境污染的加劇，由酒精性、藥物性以及免疫性因素等引發(fā)的肝病也在逐年增加。終末期肝病是各類肝病的晚期表現(xiàn)。肝移植是目前治療終末期肝病的有效方法，但由于供體受限，限制了其發(fā)展。多年來，國內(nèi)外學(xué)者致力于肝移植替代治療的研究。自1999年P(guān)etersen等[17]發(fā)現(xiàn)骨髓中有干細胞具有向肝細胞分化的潛能以來，人們開始研究應(yīng)用干細胞治療肝臟疾病的可行性，后來發(fā)現(xiàn)不同來源的干細胞如骨髓間充質(zhì)干細胞、臍血干細胞、脂肪干細胞等均可定向誘導(dǎo)分化為肝樣細胞，具有正常肝細胞生物學(xué)功能，如合成糖

原、分泌尿素、白蛋白等，且得到動物實驗的驗證，臨床亦有自體回輸骨髓干細胞治療肝病的報道。隨著研究的增加，干細胞治療為終末期肝病的治療提供了一個新的方向。

應(yīng)用細胞移植治療肝臟疾病需要大量的、功能良好的肝樣細胞，因此提供一條切實可行，經(jīng)濟方便的檢測方法尤為重要。目前的檢測方法，主要從合成白蛋白、糖原，分泌尿素及細胞色素P450功能等方面對誘導(dǎo)分化的肝樣細胞進行檢測。這些檢測多在誘導(dǎo)分化過程結(jié)束后進行，并未對整個誘導(dǎo)分化過程進行監(jiān)測。在肝細胞某些功能如儲存脂溶性維生素A、D、E和K，葉酸，維生素B12，微量元素銅、鐵等方面仍缺乏檢測技術(shù)。體外誘導(dǎo)分化的肝樣細胞要求能與在體的肝細胞生物學(xué)功能保持一致，才可能在接近生理的情況下用于研究干細胞移植、 生物人工肝供體等[18]。因此研究出特異性強、靈敏度高、對細胞或機體影響小、方法簡單易行的檢測技術(shù)是保證干細胞治療有效、安全地用于基礎(chǔ)及臨床研究的重中之重。

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