膠體金免疫層析試紙條在禽病檢測方面的應用與展望

秦立得，南文龍，陳義平（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島　266032）

膠體金免疫層析試紙條在禽病檢測方面的應用與展望

秦立得，南文龍，陳義平
（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島266032）

膠體金免疫層析試紙條作為檢測工具，具有特異性強、使用方便、結(jié)果易于判斷等優(yōu)點，被廣泛應用于基層和現(xiàn)場檢測。目前，已研發(fā)出多種應用于禽病抗原和抗體檢測的膠體金免疫層析試紙條。本文從膠體金免疫層析試紙條的技術(shù)原理、研究進展及發(fā)展方向等方面進行簡要綜述。

膠體金免疫層析試紙條；禽??；研究進展；展望

膠體金免疫層析試紙條（Immunochromatographic Strip，ICS/Colloid Gold Strip，CGS），通常簡稱為膠體金試紙條，是通過膠體金免疫層析技術(shù)制備的，可以準確、快速、低成本檢測抗原或抗體的試紙。1857年，法拉第最早用還原法制備出膠體金溶液。1971年，F(xiàn)aulk和Taylor［1］用與膠體金結(jié)合的兔抗沙門氏菌血清，檢測沙門氏菌表面抗原的分布，首次將膠體金應用于免疫分析領(lǐng)域。1990年，Osikowicz 和Beggs等建立了膠體金免疫層析技術(shù)，并應用于人類絨毛腺激素的定性檢測。目前，膠體金試紙條在病原、抗生素、農(nóng)藥殘留等檢測方面已得到了廣泛應用。

在禽病檢測方面，膠體金試紙條作為一種檢測工具，應用于疾病的診斷、流行病學調(diào)查、免疫方案制定、檢驗檢疫等方面。與其他免疫學和分子生物學檢測方法相比，膠體金試紙條具有無需專業(yè)儀器，檢測耗時短，通過肉眼觀察即可判定結(jié)果，較好的特異性和敏感性，易于運輸和保存，適用于基層和現(xiàn)場檢測。

1　檢測原理

膠體金試紙條以膠體金為標記物，利用特異性抗原抗體反應，通過反應后產(chǎn)生的肉眼可直接觀察的顏色變化來判定結(jié)果。在禽病檢測方面，大部分膠體金檢測試紙條采用雙抗夾心法檢測病原或雙抗原夾心法檢測抗體。這兩種方法基本原理相同，均以條狀的纖維層材料為固相載體，以玻璃纖維膜來容納金標抗體或抗原，將已知的特異性抗原或者抗體固定于硝酸纖維素膜上作為檢測線，同時在檢測線附近固定可與金標物相結(jié)合的抗原或抗體作為質(zhì)控線。進行樣品檢測時，在樣品墊上滴加待檢測樣品后，玻璃纖維膜中的膠體金標記抗體或抗原會與待檢測目的抗原或抗體結(jié)合形成金標復合物，當金標復合物泳動至檢測線時，構(gòu)成檢測線的無色檢測物與膠體金標記復合物結(jié)合，檢測線顏色變?yōu)榧t色或紫紅色；若樣品中不含目的抗原或抗體，則檢測線不變色。

2　禽病檢測方面的應用

2.1 禽流感

禽流感由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）感染所致，對禽養(yǎng)殖業(yè)及人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。根據(jù)AIV囊膜上血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）不同，可分為16個HA亞型和10個NA亞型［2］。

在AIV抗體檢測方面，崔尚金等［3］用滅活的H5N1禽流感病毒和桿狀病毒表達HA蛋白研制了檢測H5亞型AIV抗體的膠體金試紙條，使用該試紙條和血凝抑制實驗同時檢測830份H5N1 AIV免疫雞血清樣品，與血凝抑制實驗結(jié)果相比，該試紙條檢測靈敏度為88.8%，符合度為97.6%；其中檢測免疫60天后血清樣品時，該試紙條靈敏度和特異性與血凝抑制實驗相同。Cheng Yuling等［4］用兔抗雞IgG和H6N1型AIV制備膠體金標物，以檢測雞抗AIV核蛋白與基質(zhì)蛋白抗體作為檢測線，研制出檢測所有亞型AIV抗體的膠體金試紙條，使用該試紙條和血凝抑制實驗檢測326份樣品，試紙條檢測結(jié)果與血凝抑制結(jié)果不存在顯著差異（P＜0.001），靈敏度和特異性分別為95.2%和94.3%。

在AIV病原檢測方面，Yoshimi Tsuda等［5］以兩株AIV H5亞型血凝素單克隆抗體制備了檢測H5亞型AIV的膠體金試紙條，該試紙條檢測靈敏度可達103.5～105.5EID50；使用該試紙條檢測H5N1 AIV感染雞，感染后48小時氣管拭子檢測呈陽性。彭伏虎等［6］用AIV H9亞型血凝素單克隆抗體和雞抗AIV IgG分別作為標記物和檢測線，制備了檢測H9型亞AIV膠體金試紙條，該試紙條可檢測到0.25血凝單位的病毒，較血凝實驗靈敏度提高4倍；使用該試紙條和病毒分離方法檢測157份泄殖腔和氣管拭子樣品，該試紙條檢測出26份H9陽性樣品，與病毒分離實驗一致。徐一鳴等［7］以AIV H3和H7型血凝素蛋白單克隆抗體與馬抗H3和H7型AIV多克隆抗體分別作為待標記物和檢測線，制備了可同時檢測H3和H7型AIV膠體金檢測試紙條，靈敏度與血凝實驗相當。

2.2 新城疫

新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的，長期以來對禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大危害。在NDV抗體檢測方面，李希友等［8］用膠體金標記新城疫病毒，制作了檢測NDV抗體的免疫膠體金試紙條，使用IDEXX公司標準NDV陰性和陽性血清測定，該試紙條檢測血凝抑制抗體最低滴度為41og2；使用該試紙條和血凝抑制方法同時檢測60份樣品，試紙條檢測結(jié)果與血凝抑制試驗法檢測結(jié)果符合率為93.8%。

在NDV檢測方面，高玲美等［9］以雞抗NDV抗體制備金標抗體，兔抗雞IgG作為檢測線，研制出檢測NDV的膠體金試紙條，用該試紙條和病毒分離法共同檢測已知血清和臨床樣品共計100份，試紙條陽性檢出率為94%，病毒分離法陽性檢出率為96%，兩者符合度為93%，表明該試紙條與病毒分離結(jié)果有較高的符合度。2009年李蓓蓓等［10］以兩株NDV單克隆抗體作為免疫標記物和檢測線，制備了檢測NDV的膠體金試紙條，靈敏度比HA試驗結(jié)果提高8倍。

2.3 傳染性法氏囊病

傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的，主要感染幼雞的急性高度接觸性傳染病。在IBDV抗體檢測方面，2011年Isa Nurulfiza等［11］以雞抗IBDV血清和滅活I(lǐng)BDV作為待標記物和檢測線，研制出檢測IBDV抗體的膠體金試紙條，使用該試紙條和BioCheck公司ELISA試劑盒檢測已知陽性樣品時，該試紙條檢測準確度與商品化ELISA試劑盒相同，靈敏度高于商品化ELISA試劑盒，最短僅2分鐘即出結(jié)果。

在IBDV檢測方面，張改平等［12］以IBDV單克隆抗體制備膠體金標記物，研制出IBDV檢測膠體金試紙條。該試紙條檢測靈敏度高，實驗條件下以強毒感染雞36 h后，檢測結(jié)果呈陽性。用該試紙條、瓊擴實驗和ELISA平行檢測40份陽性樣品，結(jié)果顯示該試紙條靈敏度與ELISA相當，比瓊擴試驗提高了32～64倍；用上述三種方法檢測238份臨床樣品和289份陽性樣品，該試紙條與瓊擴試驗、ELISA檢測靈敏度相同，陽性符合率為100%。

2.4 雞傳染性支氣管炎

雞傳染性支氣管炎是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus， IBV）引起的雞的一種呼吸道傳染性疾病，在我國雞群中廣泛存在。Zhang Jinliang等［13］用鼠抗雞IgG單克隆抗體和大腸桿菌表達IBV核衣殼蛋白分別制備了膠體金標記物和檢測線，研發(fā)出檢測IBV抗體的膠體金試紙條。同時使用該試紙條、血凝抑制實驗和IDEXX公司商品化ELISA試劑盒檢測120份血清樣品。結(jié)果顯示，與血凝抑制實驗相比該試紙條檢測敏感性為92.11%，陽性符合率為85%；與商品化ELISA試劑盒相比該試紙條檢測敏感性為92.31%，陽性符合率為95%。

2.5 禽白血病

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的腫瘤性疾病。Qian Kun等［14］以兩株ALV衣殼蛋白單抗研發(fā)出檢測ALV的膠體金試紙條。該試紙最低可以檢測出600 pg重組病毒衣殼蛋白或70個TCID50的病毒；用該試紙條與IDEXX公司ELISA試劑盒檢測361份泄殖腔拭子、76份1日齡雛雞胎糞和663份分離毒株等3種樣品（共1 100份），與ELISA試劑盒相比，該試紙條檢測3種樣品的符合率分別為93.91%、93.42%、100%，靈敏性分別為93.44%、94.12%、100%，特異性分別為94.00%、93.22%、100%；使用該試紙條、IDEXX公司ELISA試劑盒和PCR法共同檢測20份疑似陽性樣品，結(jié)果顯示ICS與商品化ELISA試劑盒檢測結(jié)果一致（19份呈陽性），與PCR方法符合率為95%（PCR檢測結(jié)果為20份陽性）。

2.6 其它禽病

王愛華等［15］制備了檢測減蛋綜合征病毒（Egg drop syndrome virus，EDSV）的膠體金試紙。該試紙條能檢出濃度為1.35 μg/mL的EDSV。用該試紙條和血凝實驗（HA）平行檢測135份疑似陽性樣品，ICS檢測陽性率為52.6%，HA檢測陽性率為58.5%，與HA相比，ICS檢測陽性符合率為89.9%。

Shen Chanjuan等［16］制備了檢測鴨瘟病毒抗體的膠體金試紙條。使用該試紙條、高特異性ELISA試劑盒與中和實驗平行檢測110份臨床血清樣品。結(jié)果顯示，與ELISA試劑盒相比，ICS陽性符合率為85.37%，陰性符合率為82.61%；與中和實驗相比，ICS陽性符合率為19.51%，陰性符合率為75.36%；統(tǒng)計分析顯示，該試紙條檢測靈敏性與ELISA試劑盒無顯著差異，并顯著高于中和實驗。

陳素娟等［17］制備了檢測鴨里默桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）的膠體金試紙條。該試紙條可檢測到1、2、3、11型RA，最低可檢測到6×103CFU的RA。使用該試紙條與細菌分離法檢測疑似陽性樣品，結(jié)果顯示該試紙條檢測靈敏度高于細菌分離實驗，病料中RA的檢出率為100%，與細菌分離實驗相比陽性符合率為88.9%。

3　展望

3.1 提升檢測靈敏度

與分子檢測技術(shù)相比，部分膠體金免疫層析試紙條存在著檢測靈敏度低、假陰性結(jié)果等缺陷。膠體金銀擴增免疫層析技術(shù)是基于攝影技術(shù)的免疫層析方法，結(jié)合有抗體的膠體金顆粒會使銀離子濃縮還原形成銀原子，并在膠體金金微粒周圍形成直徑為5～10 μm的銀簇，使標記物的體積增加到膠體金微粒直徑的100倍，從而使檢測能力大大提高。Mitamura K等［18］運用膠體金銀擴增免疫層析技術(shù)制備了檢測H5N1亞型禽流感病毒的試紙條，與普通的膠體金試紙條相比，其檢測靈敏度提高了500倍。

3.2 區(qū)分野生型毒（菌）株與疫苗毒（菌）株

疫苗作為動物疫病防控的重要手段得到了廣泛的應用，但疫苗的使用往往會干擾動物疫病診斷和監(jiān)測。研制膠體金免疫層析試紙條時，可選用能區(qū)分野生型毒（菌）株與疫苗毒（菌）株的單克隆抗體或蛋白，從而獲得能區(qū)分野毒（菌）株與疫苗毒（菌）株的膠體金試紙條。郭佃磊等［19］選用一株能特異性識別偽狂犬病野生型毒株的單克隆抗體，制備了檢測野生型偽狂犬病病毒抗體的試紙條，使用該試紙條和IDEXX公司ELISA試劑盒平行檢測樣品，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)該試紙條與商品化ELISA試劑盒檢測結(jié)果相符。

3.3 同一試紙條進行多疾病檢測

疾病種類繁雜，并且許多疾病臨床癥狀相似，出現(xiàn)混合感染。將易發(fā)生混合感染或常見的多種抗體或病原膠體金檢測方法整合到同一膠體金試紙條中，可有效擴大試紙條檢測范圍，提高檢測效率。Li Jinfeng等［20］制備了可同時檢測禽流感病毒和新城疫病毒的膠體金銀擴增免疫層析試紙條。該試紙條可同時檢測AIV和NDV病毒，且檢測靈敏度較商品化膠體金試紙條提高了100倍。

3.4 實現(xiàn)抗原或抗體定量檢測

目前，大部分膠體金僅能做定性判斷。而定量膠體金檢測多根據(jù)膠體金試紙條檢測已知不同濃度標準物時檢測線存在的色差，來繪制標準物濃度與檢測線顏色關(guān)系的標準曲線。當檢測樣品時，反應完成后將試紙條檢測線顏色與標準曲線做比較，以確定待檢樣品中目的檢測物含量。

［1］ Faulk W P，Taylor G M. Communication to the editors : An immunocolloid method for the electron microscope［J］. Immunochemistry，2010，8（8）：1081.

［2］陳溥言. 獸醫(yī)傳染病學［M］. 5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011: 80-83

［3］ Cui S，Chen C，Tong G. A simple and rapid immunochromatographic strip test for monitoring antibodies to H5 subtype Avian Influenza Virus［J］. Journal of virological methods，2008，152（1/2）：102.

［4］ Cheng Y L，Wang L C，Wang C H. Immunochromatographic strip assay development for avian influenza antibody detection［J］. The Japanese journal of veterinary research，2015，63（4）：90-183.

［5］ Tsuda Y，Sakoda Y，Sakabe S，et al. Development of an Immunochromatographic Kit for Rapid Diagnosis of H5 Avian Influenza Virus Infection［J］. Microbiology & Immunology，2007，51（9）：903-907.

［6］ Peng F，Wang Z，Zhang S，et al. Development of an immunochromatographic strip for rapid detection of H9 subtype avian influenza viruses［J］. Clinical and vaccine immunology : CVI，2008，15（3）：569-574.

［7］ 徐一鳴，金寧一，楊振國，等. 膠體金方法檢測H3和H7亞型禽流感病毒［J］. 中國獸醫(yī)學報，2009，29（5）：580-583.

［8］ 李希友，田夫林，張秀娥，等. 半定量檢測新城疫抗體膠體金試紙條的研制［J］. 畜牧獸醫(yī)學報，2006，37（12）：1373-1377.

［9］ 高玲美，田夫林，牛鐘相，等. 新城疫快速診斷試紙條的研制及初步應用［J］. 中國動物檢疫，2004，21（8）：22-24. ［10］ 李蓓蓓，張帆，薛強，等. 新城疫病毒膠體金免疫層析試紙條的制備［J］. 中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（9）：122-125.

［11］ Nurulfiza I，Hair-bejo M，Omar A R，et al. Immunochromatographic gold-based test strip for rapid detection of Infectious bursal disease virus antibodies［J］. Journal of veterinary diagnostic investigation：official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians，2011，23（2）：320-324.

［12］ 張改平，李學伍，楊艷艷，等. 雞傳染性法氏囊病快速診斷試紙條的研制及特性測定［C］//中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十一次學術(shù)研討會論文集.成都：中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會，2002 .

［13］ Zhang J，Guo Y，Xiao Y，et al. A simple and rapid strip test for detection of antibodies to avian infectious bronchitis virus［J］. Journal of Veterinary Medical Science，2010，72（7）：883-886.

［14］ Qian K，Liang Y Z，Yin L P，et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus［J］. Journal of virological methods，2015，221：115-118.

［15］ 王愛華，王玉珠，孫繼國，等. 膠體金快速診斷方法對雞減蛋綜合征病毒的檢測［J］. 中國獸醫(yī)科技，2005，35（11）：856-858.

［16］ Shen C，Cheng A，Wang M，et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip test based on the recombinant UL51 protein for detecting antibody against duck enteritis virus［J］. Virol J，2010（7）：268.

［17］ 陳素娟，陳冰，孫化露，等. 鴨疫里默桿菌單克隆抗體的研制及免疫膠體金檢測方法的建立［J］. 中國獸醫(yī)學報，2012，32（11）：1651-1655.

［18］ Mitamura K，Shimizu H，Yamazaki M，et al. Clinical evaluation of highly sensitive silver amplification immunochromatography systems for rapid diagnosis of influenza［J］. Journal of virological methods，2013，194（1/2）：123-128.

［19］ Guo D L，Pan Q W，Li K P，et al. Development and clinical evaluation of a new gold-immunochromatographic assay for the detection of antibodies against field strains of pseudorabies virus［J］. Journal of virological methods，2015，222：164-169.

［20］ Li J，Zou M，Chen Y，et al. Gold immunochromatographic strips for enhanced detection of avian influenza and Newcastle disease viruses［J］. Analytica chimica acta，2013，782：54-58.

（責任編輯：杜憲）

The Application and Expectation of Using Immunochromatographic Strip in Detection of Avian Diseases

Qin Lide，Nan Wenlong，Chen Yiping
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Immunochromatographic strip（ICS），with high specificity，convenience and conspicuous resultsis，is extensively applied in grassroots level and on-site testing. Various kinds of ICS have been developed and used in detection antigen or antibody of certain avian disease. The principle research advance and expectation of ICS were discussed in this paper.

ICS；avian disease；research advance；expectation

中文分類號：S851.34A

1005-944X（2016）08-0078-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.022

種禽場疾病綜合防控與凈化技術(shù)體系評估、論證和推廣研究（2016YFD0501609）