特發(fā)性肺纖維化病人血清中SPA的表達及其臨床應(yīng)用價值

宋　磊　李　丹　竭　晶　趙　丹　華樹成　彭麗萍

(吉林大學白求恩第一醫(yī)院呼吸科，吉林　長春　130021)

?

特發(fā)性肺纖維化病人血清中SPA的表達及其臨床應(yīng)用價值

宋磊李丹竭晶趙丹華樹成彭麗萍

(吉林大學白求恩第一醫(yī)院呼吸科，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討肺表面活性蛋白A(SPA)在特發(fā)性肺纖維化(IPF)患者外周血漿中的水平及其對臨床診斷的指導意義。方法收集18例IPF患者、22例特發(fā)性非特異性間質(zhì)性肺炎(I-NSIP)患者和28例健康對照者的外周血漿，通過比較蛋白質(zhì)學篩選出差異表達的蛋白質(zhì)譜，并通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法驗證血漿該蛋白質(zhì)譜的表達。結(jié)果與I-NSIP患者以及健康對照者相比，IPF患者外周血漿中SPA表達水平明顯升高(P<0.01)，而I-NSIP患者與頭痛患者SPA水平無明顯差異(P>0.05)。血漿濃度為40.85 ng/ml可作為鑒別診斷IPF和I-NSIP的cut-off值，其敏感性和特異性分別為66.7%和86.4%。結(jié)論SPA在IPF患者外周血漿中表達上調(diào)，并且血漿SPA可作為IPF診斷的生物學標志物。

〔關(guān)鍵詞〕特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化；特發(fā)性非特異性間質(zhì)性肺炎；蛋白質(zhì)組學

第一作者：宋磊(1984-)，男，主治醫(yī)師，博士，主要從事呼吸疾病免疫學研究。

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)是一種彌漫性間質(zhì)性肺病(ILD)，診斷后中位生存期3～5年〔1〕。因其病因不明，診斷困難，無可靠有效的治療及較差的預(yù)后而備受全世界研究者的關(guān)注。特發(fā)性非特異性間質(zhì)性肺炎(I-NSIP)是對激素反應(yīng)較好的一種原發(fā)性間質(zhì)性肺炎，預(yù)后好于IPF。然而，IPF與I-NSIP的鑒別尤其困難。本課題組擬研究IPF和I-NSIP患者血漿中差異表達的蛋白，以期發(fā)現(xiàn)一組可供兩種疾病鑒別診斷的生物標志物。

1資料與方法

1.1研究對象收集2010年3月至2015年3月我院呼吸科的患者68例，年齡45～75歲，男女不限。IPF組18例，平均年齡51歲，男10例，女8例，吸煙人數(shù)占32%，F(xiàn)VC%為56%，DLCO占47%；納入標準：無外科肺活檢者：高分辨率CT表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)，對疑診IPF、CT表現(xiàn)為可能普通型間質(zhì)性肺炎型和不符合UIP的患者需要外科肺活檢進行病理診斷，結(jié)合患者的CT和病理學表現(xiàn)，進行多學科討論，最后診斷IPF。I-NSIP組22例，平均年齡53歲，男14例，女8例，吸煙占27%，F(xiàn)VC%為63%，DLCO占54%，納入標準：高分辨率CT(HRCT)表現(xiàn)與NSIP一致，不符合其他疾病如UIP或慢性過敏性肺炎表現(xiàn)，和(或)肺活檢顯示NSIP病理類型。健康對照者為我院參加正常體檢的45～75歲成人群體中募集。健康成人定義為沒有任何呼吸系統(tǒng)疾病的診斷，沒有其他疾病診斷，過去4 w沒有應(yīng)用抗生素或無急性呼吸道感染癥狀。HC組共28例，平均年齡49歲，男16例，女12例，吸煙人數(shù)占30%，F(xiàn)VC%為103%，DLCO占98%。

1.2主要試劑和儀器肺表面活性蛋白A(SPA)ELISA試劑盒(Abcam，美國)，酶標儀(Bio-Tek，美國)，質(zhì)譜儀(Ettan MALDI-Tof/Pro，美國)。

1.3檢測方法

1.3.1蛋白質(zhì)組學檢測首先選擇IPF患者和I-NSIP患者各10例的血漿標本，去除12種血液含量最豐富的蛋白質(zhì)。處理后的樣本繼而進行差異凝膠電泳(DIGE)。采用DeCyder二維軟件6.5版進行圖像分析，找出兩組間差異表達的蛋白質(zhì)斑點，差異表達超過1.5倍的蛋白可選擇進行下一步研究。選擇差異表達排在前50位的50種蛋白作為標志物分析。使用質(zhì)譜儀對50個蛋白斑點進行質(zhì)譜鑒定。

1.3.2ELISA檢測采集靜脈血5 ml，不抗凝，800 r/min離心10 min后取血漿。并留取患者血漿3 ml用于常規(guī)生化檢測，1 ml離心后取上清液分裝儲存于-80℃冰箱中保存。測定時將樣品放于冰上解凍，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。在450 nm處測各樣品的OD值，根據(jù)標準品繪制的標準曲線方計算各樣品的濃度。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS15.0軟件進行t檢驗、方差分析和ROC曲線分析。

2結(jié)果

2.1血漿差異蛋白質(zhì)譜通過DIGE共發(fā)現(xiàn)差異表達超過1.5倍的蛋白132種，對差異表達排在前50位的50種蛋白進行質(zhì)譜鑒定。排除某些蛋白為同一個蛋白的不同異構(gòu)體或單體，最終鑒定得到的蛋白為32個，包括SPA。其他鑒定出的蛋白還有SPD和八肽膽囊收縮素(CCK-8)等。本研究將采用在IPF和I-NSIP患者中表達差異最顯著的SPA作為對象進一步加以研究。見圖1。

左、右圖分別為IPF患者和I-NSIP患者外周血中蛋白電泳圖，箭頭所示即為兩者表達差異的蛋白SPA圖1　血漿蛋白電泳圖

2.2血漿和血漿中SPA的表達通過ELISA法檢測可知，IPF組患者血漿中SPA的含量為(46.16 ± 2.77)ng/ml，而I-NSIP患者和健康對照血漿中的SPA的含量分別為(33.99 ± 1.55)ng/ml和(31.23 ± 1.34)ng/ml，IPF組患者血漿中SPA水平要明顯高于后兩者(P<0.05)。

2.3SPA對IPF的診斷價值血漿SPA可作為IPF和I-NSIP鑒別診斷的血漿生物學標志物，其最佳診斷切點值(cut-off)為40.85 ng/ml(AUC=0.867，P<0.01)，此值在診斷IPF時的敏感性和特異性分別為66.7%和86.4%。見圖2。

圖2　血漿SPA水平診斷價值的ROC曲線

3討論

IPF組織病理學和放射學表現(xiàn)為UIP〔2〕。目前，IPF的實驗室診斷手段主要依賴于HRCT與肺活檢，但其他類型的間質(zhì)性肺疾病患者在臨床癥狀、體征及CT影像描述上經(jīng)常表現(xiàn)出與IPF很大的相似性。因此，臨床上需要更精確的實驗將IPF患者從其他ILD患者中篩選出來，以預(yù)測初診ILD患者對治療的反應(yīng)和預(yù)后，指導盡早選擇合適的治療方案。

近年來，蛋白質(zhì)組學飛速發(fā)展，越來越多的研究開始關(guān)注多肽組質(zhì)譜圖特征性的變化作為不同疾病變化指示劑在醫(yī)療方面的潛在應(yīng)用。在人血漿多肽組中含有約5 000個獨特的肽段，尋找和發(fā)現(xiàn)有價值的生物標志物已經(jīng)成為目前醫(yī)學研究的一個重要熱點。多學科領(lǐng)域研究證實，比較蛋白質(zhì)組學是獲取疾病新信息的重要手段，尤其是對于病因及發(fā)病機制不明確、疾病進展不可預(yù)測的疾病。到目前為止，已發(fā)表的相關(guān)文章涉及冠心病領(lǐng)域，神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腎臟疾病等。在間質(zhì)性肺疾病研究領(lǐng)域，一些研究已經(jīng)應(yīng)用該方法在IPF患者和正常對照人群的肺泡灌洗液中或IPF患者和結(jié)節(jié)病患者、系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)的肺間質(zhì)纖維化的肺泡灌洗液中鑒定出有診斷意義的生物標志物〔3〕。但目前尚無針對IPF和I-NSIP的比較蛋白質(zhì)組學研究。肺表面活性物質(zhì)(PS)是由Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌的一種脂蛋白復(fù)合體，主要成分為二棕桐肽卵磷脂和一些特異性蛋白質(zhì)，主要功能是降低肺泡表面張力并維持肺泡更新和內(nèi)穩(wěn)態(tài)〔4〕。表面活性蛋白(SP)是PS重要組成成分，包括SPA、SPB、SPC和SPD共4種，其中SPA含量最為豐富，約占SP總量的50%〔4〕。SPA具有局部防御、調(diào)節(jié)免疫和炎性反應(yīng)以及促進肺泡代謝、穩(wěn)定PS的作用〔5〕。在生理情況下，正常人肺泡-毛細血管屏障完好，可以阻止SPA進入血液循環(huán)，血漿中SPA水平很低。但在某些病理情況下，由于肺泡-毛細血管屏障的破壞，外周血中SPA可出現(xiàn)異常增多，并與多種肺部疾病的臨床情況密切相關(guān)〔6〕。本研究發(fā)現(xiàn)IPF患者血漿中SPA水平上調(diào)?？紤]上述現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是由于在IPF患者中Ⅱ型肺泡上皮發(fā)生不可逆的大量損壞，細胞中的SPA釋放入血所致。

到目前為止，已有的研究多從已知的病理生理改變及可能的發(fā)病機制入手，采用ELISA或免疫組化等方法對預(yù)想的蛋白做特異性檢測，雖然樣本規(guī)模有限，并缺少可重復(fù)性，但都表現(xiàn)出對IPF發(fā)生或其結(jié)果的判斷意義，這些研究發(fā)現(xiàn)的生物標志物包括外周血中的蛋白，如KL-6，SP-A、SP-D，MMP-1、7，CCK-18，YKL-40，S100A9等〔7〕。

綜上，本研究結(jié)果不僅提示新型生物學標志物在IPF診斷應(yīng)用中的潛在價值，還有可能為新型藥物的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

4參考文獻

1Kim HJ，Perlman D，Tomic R.Natural history of idiopathic pulmonary fibrosis〔J〕.Respir Med，2015；109(6)：661-70.

2Prasad R，Gupta N，Singh A，etal.Diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis：current issues〔J〕.Intractable Rare Dis Res，2015；4(2)：65-9.

3Hara A，Sakamoto N，Ishimatsu Y，etal.S100A9 in BALF is a candidate biomarker of idiopathic pulmonary fibrosis〔J〕.Respir Med，2012；106(4)：571-80.

4Whitsett JA，Wert SE，Weaver TE.Diseases of pulmonary surfactant homeostasis〔J〕.Ann Rev Pathol，2015；10(4)：371-93.

5Awasthi S.Surfactant protein (SP)-A and SP-D as antimicrobial and immunotherapeutic agents〔J〕.Recent Pat Antiinfect Drug Discov，2010；5(2)：115-23.

6Iwamoto H，Gao J，Koskela J，etal.Differences in plasma and sputum biomarkers between COPD and COPD-asthma overlap〔J〕.Eur Respir J，2014；43(2)：421-9.

7Ley B，Brown KK，Collard HR.Molecular biomarkers in idiopathic pulmonary fibrosis〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2014；307(9)：L681-91.

〔2015-06-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：彭麗萍(1964-)，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，主要從事慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機制研究。

基金項目：吉林省科技廳科研基金資助(No.20130206103SF)

〔中圖分類號〕R563.9

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6465-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.071