楊曉帆　韓鵬飛　臧兆萍　陳　培

(牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江　牡丹江　157011)

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人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植對老年帕金森病大鼠的作用

楊曉帆韓鵬飛1臧兆萍2陳培3

(牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江牡丹江157011)

〔摘要〕目的探討人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植對老年帕金森病(PD)大鼠的作用。方法SD大鼠分為重組GDNF腺病毒(Ad-GDNF)組、LacZ 腺病毒(Ad-LacZ)組和磷酸緩沖液(PBS)組。將重組腺病毒及PBS定向注射至一側(cè)黑質(zhì)附近,1 w后于同側(cè)紋狀體注射6-羥基多巴胺(OHDA)誘發(fā)多巴胺(DA)能神經(jīng)元進(jìn)行變性。通過旋轉(zhuǎn)行為觀察和中腦酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色及紋狀體單胺類遞質(zhì)高壓液相色譜-電化學(xué)儀(HPLC-ECD)檢測評估其治療效應(yīng);通過RT-PCR、ELISA檢測Ad-GDNF 腦內(nèi)表達(dá)情況。結(jié)果Ad-GDNF組大鼠的平均旋轉(zhuǎn)次數(shù)顯著少于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，損毀側(cè)/損毀對側(cè)黑質(zhì)的TH陽性細(xì)胞百分比顯著高于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，DA、高香草酸(HAV)、3，4二羥基苯乙酸(DOPAC)損毀側(cè)/損毀對側(cè)百分比均顯著高于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，病毒注射后5 w的GDNF含量顯著高于Ad-LacZ 對照組和PBS對照組(P<0.05)，病毒注射后9 w的GDNF含量顯著高于Ad-LacZ 對照組(P<0.05)。結(jié)論人GDNF轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植對老年P(guān)D大鼠具有一定的保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；神經(jīng)干細(xì)胞移植；帕金森病

1牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院檢驗科

2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

3牡丹江醫(yī)學(xué)院病理生理教研室

第一作者：楊曉帆(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腦老化與腦血管病研究。

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)作為一種新型強(qiáng)效的多巴胺(DA)能神經(jīng)元神經(jīng)營養(yǎng)因子被認(rèn)為是一種潛在的帕金森病(PD)保護(hù)性治療藥物,研究〔1〕顯示將GDNF 蛋白直接注射到多種PD 動物模型黑質(zhì)或紋狀體,均可有效阻止DA 能神經(jīng)元變性丟失。GDNF 臨床應(yīng)用的主要障礙是給藥不便,因其不易透過血腦屏障。利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使其在病變區(qū)直接表達(dá)是克服這一問題的重要發(fā)展方向。本實驗利用偏側(cè)PD 大鼠模型探討腺病毒介導(dǎo)的GDNF 基因直接轉(zhuǎn)移對PD 的保護(hù)性治療作用。

1材料與方法

1.1一般材料LacZ腺病毒(Ad-LacZ)、重組GDNF腺病毒(Ad-GDNF)由美國密歇根大學(xué)提供，6-酪氨酸羥化酶(TH)單抗、羥基多巴胺(6-OHDA)由美國Sigma 公司生產(chǎn)，酶標(biāo)EnVision 二抗是美國DaKo公司產(chǎn)品，X-gal是華美公司生產(chǎn)，GDNF ELISA試劑盒是美國Promega 公司生產(chǎn)，RNA 提取試劑Trizol是美國Gibco生產(chǎn)，RT-PCR試劑盒是日本TaKaRa 公司生產(chǎn)，PCR 引物是上海生工公司生產(chǎn)，SD大鼠由中英合資上海西普爾BK 實驗動物有限公司提供。人GDNF和大鼠β-actin引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1。

1.2分組70只SD大鼠均為雄性，月齡為6個月，體重200～250 g，平均(225±25)g。隨機(jī)分為Ad-GDNF組26只、Ad-LacZ組26只、磷酸緩沖液(PBS)組18只。

表1　人GDNF和大鼠β-actin引物序列及擴(kuò)增片段長度

1.3腺病毒和PBS黑質(zhì)定向注射向右側(cè)黑質(zhì)附近注射腺病毒或PBS，注射過程中嚴(yán)格依據(jù)下列坐標(biāo)：前囟后、中線旁開、顱骨下分別為5.3、1.9、7.5 mm。在PBS中懸浮Ad-GDNF和Ad-LacZ，給予Ad-GDNF組1 μl/min的速度注射6×109顆粒(3 μl,1.2×107噬斑)病毒，給予Ad-LacZ組1 μl/min的速度注射1×107顆粒(3 μl,7.5×106噬斑)病毒，給予PBS組1 μl/min的速度注射等體積PBS。完成注射后進(jìn)行10 min的留針后以較慢的速度退出〔1,2〕。

1.46-OHDA紋狀體立體定向注射定向注射腺病毒或PBS 1 w后向右側(cè)紋狀體注射4 μg/μl的4 μl 6-OHDA，注射過程中分4點，并嚴(yán)格依據(jù)下列坐標(biāo)：前囟前、中線旁開、顱骨下分別為1.2 mm和1.2 mm，2.5 mm和3.5 mm，4.5、6.5 mm和4.5、6.5 mm。每點的注射速度和注射量均分別為1 μl/min和1 μl。完成注射留針5 min后以較慢的速度退出〔3,4〕。

1.5旋轉(zhuǎn)行為觀察完成注射6-OHDA后2 w和6 w給予大鼠腹腔注射0.25 mg/kg阿撲嗎啡，以對其旋轉(zhuǎn)進(jìn)行誘發(fā)，觀察旋轉(zhuǎn)行為變化〔5，6〕。

1.6TH免疫組化檢測腺病毒感染7 w后3組各取10只大鼠，給予升主動脈灌注200 ml pH值為7.2的4%多聚甲醛固定，取中腦進(jìn)行TH免疫組化，觀察中腦多巴胺(DA)能神經(jīng)元損毀情況。將每只大鼠腺病毒或PBS注射點附近的中腦中部的5個切片斷面取出，計數(shù)兩側(cè)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)，計算損毀側(cè)和對側(cè)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)百分比〔7,8〕。

1.7高壓液相色譜-電化學(xué)(HPLC-ECD)檢測紋狀體單胺類遞質(zhì)取出病毒感染后5、7、9 w三組大鼠的雙側(cè)紋狀體，分別有6只、6只、4只，運(yùn)用HPLC-ECD檢測DA、高香草酸(HVA)、3,4二羥基苯乙酸(DOPAC)、5-羥吲哚乙酸(HIAA)、5-羥色胺(HT)含量〔9,10〕。

1.8外源性基因表達(dá)檢測病毒感染后6 w取中腦組織，運(yùn)用RT-PCR檢測GDNF表達(dá)，運(yùn)用X-gal化學(xué)染色法檢測LacZ基因表達(dá)。此外，病毒感染后5、9 w分別取出大鼠右側(cè)中腦腹側(cè)1/3組織，各6只，稱重，加入裂解液過程中嚴(yán)格依據(jù)200 μl/10 mg腦組織，NaCl、Tris(pH7.6)、PMSF、Leupeptin、Glycerol、NP-401分別為137 mmol/L、20 mmol/L、1 mmol/L、1 μg/ml、10%、1%，充分研磨成勻漿，4℃離心15 min，12 000 r/min。取上清，同等條件下再離心10 min。取上清，運(yùn)用ELISA法檢測GDNF，上樣過程中每個標(biāo)本做1∶2、1∶4、1∶8、1∶16系列稀釋度〔11,12〕。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

2結(jié)果

2.1三組旋轉(zhuǎn)行為比較Ad-GDNF 組平均旋轉(zhuǎn)次數(shù)〔(5.4±15.2)次〕顯著少于Ad-LacZ組和PBS組〔(30.0±27.7)次、(40.8±25.0)次〕(P<0.05)。

2.2三組兩側(cè)黑質(zhì)的TH陽性細(xì)胞計數(shù)比較Ad-GDNF 組損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞計數(shù)、損毀側(cè)/損毀對側(cè)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞百分比顯著高于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，見表2。

表2　三組兩側(cè)黑質(zhì)的TH陽性細(xì)胞計數(shù)比較±s)

與Ad-LacZ組比較：1)P<0.05；與PBS組比較：2)P<0.05；下表同

2.3三組紋狀體單胺類遞質(zhì)檢測結(jié)果比較Ad-GDNF 組DA、HAV、DOPAC損毀側(cè)/損毀對側(cè)百分比均顯著高于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，見表3。

2.4三組外源性基因表達(dá)檢測結(jié)果比較Ad-GDNF 組病毒注射后5 w的GDNF含量顯著高于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，病毒注射后9 w的GDNF含量顯著高于Ad-LacZ組(P<0.05)，見表4。

表3　三組紋狀體單胺類遞質(zhì)檢測結(jié)果比較±s)

表4　三組外源性基因表達(dá)檢測結(jié)果比較±s)

3討論

就神經(jīng)變性疾病而言,神經(jīng)保護(hù)性治療指那些通過影響病因及發(fā)病機(jī)制而帶來長期益處的干預(yù)措施,它應(yīng)當(dāng)能推遲發(fā)病或延緩病情的發(fā)展。盡管PD 確切病因未明,而且也未發(fā)現(xiàn)與GDNF缺乏有關(guān),但有資料〔9〕提示GDNF 不僅對DA 能神經(jīng)元正常發(fā)育和功能具有促進(jìn)作用,同時對6-OHDA、1-甲基-4-苯基-1 ,2 ,3 ,6-四氫吡啶(MPTP)、甲基安非他敏等神經(jīng)毒造成的DA 能神經(jīng)元損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用,而這些神經(jīng)毒的毒性作用機(jī)制與PD 發(fā)病機(jī)制有很多共同之處。因此,利用6-OHDA 誘發(fā)的PD動物模型來研究GDNF 基因轉(zhuǎn)移對PD 的保護(hù)性治療作用有其一定的合理性。本研究結(jié)果充分說明人GDNF轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植對老年P(guān)D大鼠具有一定的保護(hù)作用。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-05-29修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：陳培(1981-)，女，碩士，講師，主要從事腦老化與腦血管病研究。

基金項目：黑龍江教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(No.12531734)

〔中圖分類號〕R743.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6339-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.009