安　高　郭亞春　邢恩鴻　宋鴻儒　封桂英

(承德醫(yī)學(xué)院，河北　承德　067000)

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·基礎(chǔ)研究·

膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠Th1細(xì)胞及特異轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)變化

安高郭亞春邢恩鴻宋鴻儒封桂英

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000)

〔摘要〕目的研究雞Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠脾淋巴細(xì)胞Th1及其特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet動(dòng)態(tài)變化，探討Th1細(xì)胞與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)進(jìn)展的關(guān)系。方法108只DBA1/J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(每組6只)和模型組(每組12只)，于初次免疫7、14、21 d、加強(qiáng)免疫后第7、21、35天無菌摘脾臟提取脾淋巴細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾淋巴細(xì)胞Th1及其特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet變化情況。結(jié)果小鼠初免7 d和14 d模型組Th1細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子T-bet明顯高于正常組(P<0.01，P<0.05)，初免21 dTh1細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子T-bet與正常組無明顯區(qū)別(P>0.05)。加強(qiáng)免疫7 d模型組Th1細(xì)胞開始升高與正常組比較有顯著差異(P<0.01)，檢測(cè)其T-bet與正常組也有明顯區(qū)別(P<0.05)，加強(qiáng)免疫21 d模型組Th1細(xì)胞及T-bet表達(dá)量降低與正常組比較差異顯著(P<0.01，P<0.05)，加強(qiáng)免疫35 d模型組Th1細(xì)胞及T-bet表達(dá)量與正常組比較無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論CD4+Th1細(xì)胞及其特異轉(zhuǎn)錄因子動(dòng)態(tài)變化可能和RA進(jìn)展具有一定關(guān)系。

〔關(guān)鍵詞〕CIA;PCR;流式細(xì)胞術(shù)；Th1；T-bet

第一作者：安高(1987-)，男，碩士，主要從事中藥免疫學(xué)研究。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)病機(jī)制中，較為公認(rèn)的觀點(diǎn)為CD4+的Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)啟動(dòng)了RA的發(fā)生，抑制Th1細(xì)胞及細(xì)胞因子的分泌，可以抑制RA的發(fā)生和發(fā)展〔1，2〕。但在RA病程中，Th1細(xì)胞在整個(gè)病程中均起作用還是在某一特定階段起作用目前報(bào)道不一，絕大多數(shù)研究認(rèn)為Th1細(xì)胞主要在RA發(fā)病的早期起作用〔3〕。本研究旨在觀察膠原蛋白誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠脾淋巴細(xì)胞Th1細(xì)胞及其特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet的動(dòng)態(tài)變化。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器PMA/Ionomycin mixture和BFA/Monensin mixture由Multisciences提供；抗鼠CD3PECy5、抗鼠CD4 FITC，抗鼠CD8PE、抗鼠IFN-γ PE、鼠IgG1 Isotype Contol PE及鼠IgG2 FITC均為eBioscience產(chǎn)品；雞Ⅱ型膠原產(chǎn)自Chondrex；CFA為Sigma產(chǎn)品；Trizol Reagent為Invitrogen產(chǎn)品；PrimeScript RT試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ由寶生物公司生產(chǎn)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀為BD產(chǎn)品；自動(dòng)脫水機(jī)及包埋機(jī)由Thermo生產(chǎn)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性DBA1/J小鼠108只，7～8周齡〔上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)碼：SCXK(滬)2012-0002〕。

1.3方法

1.3.1建立CIA動(dòng)物模型參考文獻(xiàn)〔4〕建立CIA動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CIA模型成模率在90%以上。

1.3.2關(guān)節(jié)癥狀評(píng)分參考文獻(xiàn)〔5〕，于小鼠初次免疫后28 d用AI指數(shù)判斷模型是否成功，AI指數(shù)越高，關(guān)節(jié)炎癥越重。

1.3.3動(dòng)物分組及取材108只DBA1/J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組36只(每時(shí)間點(diǎn)6只)和模型組72只(每時(shí)間點(diǎn)12只)。無菌取部分脾臟提取淋巴細(xì)胞檢測(cè)Th1細(xì)胞，低溫下取部分脾臟分離淋巴細(xì)胞提取RNA，檢測(cè)Th1細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)Th1細(xì)胞數(shù)量制備單個(gè)脾淋巴細(xì)胞，用臺(tái)酚藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95%以上)，然后CD69染色檢測(cè)，確定淋巴細(xì)胞活化程度在90%以上。設(shè)對(duì)照管、檢測(cè)管1、檢測(cè)管2。每管加入CD4-FITC 1 μl室溫避光20 min。每管中加入100 μl固定液A，室溫避光15 min。洗滌，重懸細(xì)胞。每管中加入100 μl破膜及溶血液B，同時(shí)加入干擾素(IFN)-γ抗體。室溫避光15 min。洗滌，重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5熒光定量PCR檢測(cè)Th1細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet常規(guī)提取各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。T-bet及內(nèi)參 GAPDH 的引物為T-bet(正義5′-AGCAAGGACGGCGAATGTT-3′，反義5′-GGGTGGACATATAAGCGGTTC-3′)、GAPDH(正義5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，反義5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′)。PCR反應(yīng)按試劑盒說明進(jìn)行，T-bet退火溫度為57.5℃。按照 2-ΔΔCt法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件行方差分析及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1小鼠的一般情況加強(qiáng)免疫后模型組小鼠精神萎靡，活動(dòng)、飲食減少，體重逐漸減輕，在模型鼠免疫處的皮膚形成潰瘍，至加強(qiáng)后7 d，90%以上模型鼠AI指數(shù)在4分以上，模型鼠足墊增厚，足爪充血紅腫明顯；至加強(qiáng)免疫21 d，模型鼠足墊依然增厚，但足爪充血紅腫減輕；至加強(qiáng)免疫35 d，模型鼠足爪充血紅腫明顯減輕，足爪出現(xiàn)畸形;加強(qiáng)免疫前及正常組小鼠無上述改變。

2.2CIA小鼠脾指數(shù)變化免疫前各組小鼠脾指數(shù)無明顯差異，免疫后小鼠脾臟增大明顯，為暗紅色，初免后7 d至加強(qiáng)免疫21 d與正常組脾指數(shù)差異顯著(P<0.01)；至加強(qiáng)免疫后35 d，脾指數(shù)與正常組仍有明顯區(qū)別(P<0.05)，見表1。

2.3CIA小鼠Th1細(xì)胞及其特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet變化小鼠初免7 d和14 d，模型組Th1細(xì)胞明顯高于正常組(P<0.01)；初免21 d，Th1細(xì)胞與正常組無明顯區(qū)別。加強(qiáng)免疫7 d，模型組Th1細(xì)胞開始升高，與正常組比較有顯著差異(P<0.01)；加強(qiáng)免疫21 d，模型組Th1細(xì)胞降低，與正常組比較差異顯著(P<0.01)；加強(qiáng)免疫35 d，模型組Th1細(xì)胞與正常組比較無明顯差異，見表2。初次免疫7 d及14 d，與正常組比較，模型組T-bet表達(dá)量顯著增高(P<0.05)；至初免21 d，T-bet表達(dá)量開始下降，與正常組無明顯差異。加強(qiáng)免疫7 d，T-bet表達(dá)開始升高，與正常組有明顯差別(P<0.05)；加強(qiáng)免疫21 d，T-bet表達(dá)量有降低趨勢(shì)，與正常組比較有顯著差異(P<0.05)；到加強(qiáng)免疫35 d，T-bet表達(dá)量與正常組之間無明顯差異，見表3。

表1　小鼠脾指數(shù)動(dòng)態(tài)變化

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表2　Th1細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化

表3　Th1細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet的動(dòng)態(tài)變化

3討論

RA是目前常見的自身免疫性疾病，但其確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。盡管很多研究證實(shí)，多種免疫細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子參與了關(guān)節(jié)炎癥的病理變化過程〔6〕。但絕大多數(shù)研究認(rèn)為，Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是RA發(fā)生的啟動(dòng)因素，Th1細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的過量在RA發(fā)病機(jī)制中起著重要作用〔7〕。

Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、白介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α，通過細(xì)胞因子發(fā)揮其免疫作用。有研究證明，CIA動(dòng)物模型和RA患者外周血Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平增高〔4〕。其中TNF-α可以促進(jìn)白細(xì)胞向關(guān)節(jié)腔浸潤，上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的分泌，導(dǎo)致RA滑膜組織特征性血管翳形成。另外，TNF-α也可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，引起滑膜成纖維細(xì)胞增生及骨及軟骨損害。有研究表明，阻斷TNF-α對(duì)RA患者可以起到較好的治療作用〔8～10〕。IFN-γ可以通過刺激單核巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1等炎性細(xì)胞因子，間接地發(fā)揮促炎作用。研究RA患者滑膜組織中的T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)主要是產(chǎn)生IFN-γ及 IL-2 的Th1細(xì)胞，而且RA關(guān)節(jié)液中IFN-γ及IFN-γ陽性細(xì)胞百分率增加，關(guān)節(jié)局部出現(xiàn)Th1細(xì)胞募集現(xiàn)象〔11，12〕。但也有研究表明，關(guān)節(jié)中Th1細(xì)胞的募集僅發(fā)生在早期RA患者，慢性RA患者IFN-γ也增多，但Th1細(xì)胞會(huì)逐漸減少，以Tp細(xì)胞為主，提示RA不同的病程階段CD4+T細(xì)胞亞群比例失調(diào)〔13〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠初免7 d和14 d模型組Th1細(xì)胞明顯升高，可能和機(jī)體接觸抗原刺激后應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。加強(qiáng)免疫7 d時(shí)，絕大多數(shù)小鼠的關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)紅腫，Th1細(xì)胞明顯升高，說明Th1細(xì)胞參與了CIA小鼠的關(guān)節(jié)病變。加強(qiáng)免疫21 d模型組小鼠紅腫開始消退，Th1細(xì)胞比正常組降低，說明此時(shí)可能存在CD4+T細(xì)胞平衡紊亂；至加強(qiáng)免疫35 d，模型組小鼠足爪紅腫明顯消退，出現(xiàn)畸形，Th1細(xì)胞開始升高接近于正常組，說明Th1細(xì)胞可能參與CIA小鼠軟骨及骨的破壞。本研究進(jìn)一步應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)從分子水平驗(yàn)證了Th1細(xì)胞在CIA鼠不同病程時(shí)期的變化情況。

綜上所述，通過研究RA發(fā)病過程中Th1細(xì)胞及其特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)，可能為評(píng)價(jià)RA的病情進(jìn)展、預(yù)后及治療RA藥物的開發(fā)、篩選和機(jī)制探討提供合理的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-12-23修回〕

(編輯李相軍)

The dynamic changes of Th1 cells and specific transcription factor of collagen-induced arthritis mice

AN Gao,GUO Ya-Chun,XING En-Hong,etal.

Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei,China

【Abstract】ObjectiveTo study the dynamic changes of Th1 cells and specific transcription factor T-bet in spleen of chicken type Ⅱ collagen induced arthritis(CIA) mice and to investigate the relationship between the development of rheumatoid arthritis(RA) and the changes of Th1 cells.Methods108 DBA1/J mice were randomly divided into control group(n=6) and CIA group (n=12).They were respectively picked the spleen and extracted the lymphocytes under the sterile condition on the initial immunization 7,14,21d and 7,21,35 d after booster immunization.Then the dynamic changes of Th1 cells were detected by flow cytometry and T-bet were detected by fluorescence quantitative PCR in different periods.ResultsTh1 cells and T-bet were significantly higher in CIA group than those in normal group at 7 d and 14 d after initial immunization(P<0.01,P<0.05),but there were no significant differences between CIA and normal groups at the 21 d after initial immunization(P>0.05).Th1 cells and T-bet began to increase at the 7 d after booster immunization and there were obvious differences between CIA and normal groups(P<0.01,P<0.05).While Th1 cells and T-bet began to significantly decrease,compared with those in normal group(P<0.01,P<0.05) at the 21 d after booster immunization.At the 35 d after booster immunization there were no significant differences between CIA and normal groups (P>0.05).ConclusionsThe dynamic changes of CD4+Th1 and specific transcription factor T-bet might have a relation with the progress of RA.

【Key words】CIA;PCR;Flowcytometry;Th1;T-bet

通訊作者：宋鴻儒(1961-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥免疫學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273986)

〔中圖分類號(hào)〕R593.22；R392.11

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6321-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.001