參附注射液對(duì)膽汁環(huán)境中成纖維細(xì)胞的影響

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參附注射液對(duì)膽汁環(huán)境中成纖維細(xì)胞的影響

楊楷，劉莉，周耿，張海軍

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 探討在膽汁環(huán)境中參附注射液對(duì)成纖維細(xì)胞的影響，以判斷在此環(huán)境中成纖維細(xì)胞的增殖是否能被參附注射液抑制，從而減輕膽道瘢痕性狹窄。方法 通過(guò)建立體外膽汁環(huán)境中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)模型，運(yùn)用參附注射液干預(yù)。設(shè)計(jì)分為空白組、膽汁組、實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組又分為5個(gè)濃度梯度亞組。運(yùn)用MTT法測(cè)定各組中成纖維細(xì)胞OD值，用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,分析參附注射液是否能抑制成纖維細(xì)胞的形成。結(jié)果 成纖維細(xì)胞OD值隨參附注射液含量及干預(yù)時(shí)間的增加逐漸減小(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在膽汁環(huán)境中成纖維細(xì)胞的增殖能被參附注射液抑制。結(jié)論 參附注射液對(duì)膽汁環(huán)境中成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用。

[關(guān)鍵詞]參附注射液；成纖維細(xì)胞；膽汁環(huán)境

參附注射液來(lái)源于參附湯，是從附片、人參等中藥中提取而成[1]，屬于活血化瘀類(lèi)中藥。許多研究發(fā)現(xiàn)活血化淤類(lèi)中藥具有促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù)、抑制瘢痕增生的作用[2]。并且有研究提出，具有活血化淤作用的丹參注射液，可以在早期促進(jìn)膽道損傷后愈合，后期在一定程度上減少膽道瘢痕的過(guò)度增生[3]。其主要機(jī)理是改善微循環(huán)、降低局部的缺血缺氧狀態(tài)，以達(dá)到促進(jìn)其愈合的作用。參附同樣具有活血化瘀的作用，那么作用于受損傷的膽

管，是否也能起到相同的作用呢？由此我們?cè)O(shè)計(jì)制作成纖維細(xì)胞在體外膽汁環(huán)境中生長(zhǎng)的模型，并用參附注射液干預(yù)。分析判斷參附注射液是否能抑制體外膽汁環(huán)境中成纖維細(xì)胞的增值，從而推測(cè)出它對(duì)抑制膽道瘢痕的形成是否具有一定作用。

1材料

人瘢痕成纖維細(xì)胞株(上海漢博生物試劑公司)；T管引流術(shù)后人正常膽汁(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科提供)；參附注射液(雅安三九藥業(yè)說(shuō)明：每毫升參附注射液含紅參0.1 g，附片0.2 g，其有效藥物成分0.3g)；胎牛血清(四季青生物制品公司)；DMEM培養(yǎng)基(HyClone-PIERCE 公司)；MTT(SIGMA公司)；二甲基亞砜DMSO(SIGMA公司)；OLYPMUS BX51顯微鏡 (日本OLYPMUS公司)；SW-LG-1F超凈工作臺(tái)(蘇州安泰公司)；HPX-9082 MBE型CO2培育箱(上海博訊醫(yī)療)。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞株3～6代。按設(shè)計(jì)分組，分為膽汁組(僅含等量的膽汁培養(yǎng)基)；實(shí)驗(yàn)組參附注射液濃度梯度，分為10 mg/mL組、20 mg/mL組、40 mg/mL組、80 mg/mL組、160 mg/mL組；空白組(僅含等量培養(yǎng)液)。

2.2成纖維細(xì)胞在膽汁環(huán)境中生長(zhǎng)的模型制備[4]取經(jīng)T管引流的人正常膽汁，過(guò)濾、除菌，稀釋50倍后[4]，混合等量細(xì)胞培養(yǎng)基，配置成實(shí)驗(yàn)用膽汁培養(yǎng)基。各組濃度的參附注射液分別取2 mL，混合等量實(shí)驗(yàn)用膽汁培養(yǎng)基后加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，作為體外培養(yǎng)。pH為7.4的PBS溶解MTT(0.1mol/L)，配制成濃度為5g/L的溶液[5]。生長(zhǎng)良好的成纖維細(xì)胞，按設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)各組接種到96孔板上，每孔5×103個(gè)，重復(fù)3次。5%CO2孵箱中，設(shè)定溫度37 ℃，飽和濕度下，將各組成纖維細(xì)胞培養(yǎng)24 h。加入配制好的MTT溶液；觀察對(duì)象分別為空白組、膽汁組、實(shí)驗(yàn)組的各亞組。

2.3標(biāo)本采集不同濃度的參附藥液干預(yù)各組中生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞，時(shí)間設(shè)定12、24、48 h，MTT法測(cè)定各組成纖維細(xì)胞的OD值。

3結(jié)果

組別12h24h48hFP空白組4.27±0.254.53±0.324.17±0.320.5620.59膽汁組17.10±0.1016.93±0.0618.63±0.061251.500.0010mg/mL組15.83±0.0615.00±0.1014.90±0.10166.500.0020mg/mL組14.87±0.1514.50±0.1013.33±0.20123.440.0040mg/mL組13.63±0.2312.87±0.1511.67±0.5933.410.0080mg/mL組10.63±0.158.87±0.208.73±0.25136.500.00160mg/mL組7.77±0.126.77±0.065.87±0.3296.780.00F2416.512319.96822.96P0.000.000.00

3.1.1空白組中OD值隨時(shí)間增加無(wú)明顯變化,組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.562,P>0.05)。

3.1.2同一時(shí)間點(diǎn)，膽汁組OD值明顯小于空白組OD值，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組OD值隨參附注射液濃度的增加而減小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3.1.3同一濃度中，隨參附注射液干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)成纖維細(xì)胞的OD值下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3.2光鏡觀察

3.2.1成纖維細(xì)胞數(shù)量在空白組中較少，細(xì)胞核較小，排列較稀松(見(jiàn)圖1A)。

3.2.2成纖維細(xì)胞在膽汁組中數(shù)量較多，細(xì)胞核較大，核仁較清晰，排列較緊密(見(jiàn)圖1B)。

3.2.3按照各實(shí)驗(yàn)組與空白組平均吸光值的比值求出細(xì)胞存活率，依據(jù)濃度-存活率求出其存活率為50%的藥物濃度，既50%IC的藥物濃度為60 mg/mL。以此濃度的參附注射液對(duì)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞分別干預(yù)12、24、48 h，通過(guò)光鏡觀察到成纖維細(xì)胞胞核明顯，細(xì)胞突起部分回縮，表明其活性下降，增殖可能都受到了抑制[2](見(jiàn)圖2A、B、C)。

A:空白組48 h；B:膽汁組48 h。圖1　成纖維細(xì)胞形態(tài)(×400)

A:60 mg/mL參附注射液干預(yù)12 h;B:60 mg/mL參附注射液干預(yù)24 h;C:60 mg/mL參附注射液干預(yù)48 h。圖2　參附注射液干預(yù)后各時(shí)段的成纖維細(xì)胞形態(tài)(×400)

4討論

膽管是膽汁排入腸道的唯一通路，它與人類(lèi)的健康息息相關(guān)。膽道損傷一旦發(fā)生，如果早期處理不當(dāng)就會(huì)出現(xiàn)膽管瘢痕性攣縮，造成膽道狹窄，治療起來(lái)非常困難的，給患者帶來(lái)極大痛苦。

膽道手術(shù)及胃腸道手術(shù)有時(shí)會(huì)造成膽管的意外損傷，也就是醫(yī)源性膽管損傷。其中90%由膽囊切除術(shù)造成，5%來(lái)源于膽管手術(shù)，3%來(lái)源于胃大部切除手術(shù)。特別是腹腔鏡技術(shù)近年來(lái)得到長(zhǎng)足的發(fā)展，廣泛運(yùn)用于膽囊、胃、十二指腸、肝臟切除術(shù)中，膽管損傷也隨之增多，并且有逐年上升的趨勢(shì)。

膽管損傷如在術(shù)中發(fā)現(xiàn)，通常處理起來(lái)會(huì)比較容易，預(yù)后相對(duì)較好。如術(shù)后才發(fā)現(xiàn)，滲漏的膽汁刺激周?chē)M織，發(fā)生炎性改變，結(jié)締組織增生，絕大多數(shù)會(huì)造成膽管狹窄。伴隨膽管瘢痕狹窄，膽汁引流不暢、淤積，出現(xiàn)黃疸和反復(fù)發(fā)作膽道感染，甚至有可能造成膽汁淤積性肝硬化、門(mén)靜脈高壓癥等，使肝臟功能出現(xiàn)難以逆轉(zhuǎn)的損害。手術(shù)修復(fù)后往往還會(huì)再次出現(xiàn)膽道瘢痕性狹窄，形成一個(gè)惡性循環(huán)。

膽管損傷后纖維化是造成狹窄的主要原因[6]，瘢痕性攣縮和良性狹窄是其最明顯的表現(xiàn)。在膽管損傷瘢痕愈合這一過(guò)程中，膽汁刺激黏膜成纖維細(xì)胞，使其逐漸轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，并伴隨膠原纖維過(guò)度合成[7]，導(dǎo)致癱痕攣縮，引起膽道狹窄。膽道瘢痕化愈合表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的過(guò)度增生，而整個(gè)過(guò)程是在膽汁的浸泡中完成的。膽汁會(huì)致纖維化和阻礙損傷組織愈合[8]；膽汁與膠原纖維接觸，會(huì)增加炎癥反應(yīng)[9]，這些因素均會(huì)引起或加重膽管狹窄，這已在犬膽道損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)[10]。

通過(guò)改善微循環(huán)，可以促進(jìn)瘢痕的愈合。研究證實(shí)參附具有提高細(xì)胞抗應(yīng)激及耐受缺氧、減少細(xì)胞缺血再灌注損傷、保護(hù)細(xì)胞功能的作用。還有使局部微循環(huán)得以改善，促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，加快傷口愈合的作用。并且有特異性提高細(xì)胞免疫功能的作用[11-13]。

在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，膽汁組中測(cè)得成纖維細(xì)胞OD值與空白組測(cè)得OD值比較，在同一時(shí)間點(diǎn)明顯增大，說(shuō)明膽汁能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)組與膽汁組比較，隨著參附注射液濃度的增加，在同一時(shí)間段成纖維細(xì)胞OD值有減小的趨勢(shì)。說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨參附注射液濃度的增加能逐步減少膽汁環(huán)境中成纖維細(xì)胞的增殖。在同一濃度組中，隨參附注射液干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，膽汁環(huán)境中成纖維細(xì)胞的OD值有減小的趨勢(shì)。說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨參附注射液干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，能逐漸減少膽汁環(huán)境中成纖維細(xì)胞的增殖。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，也可發(fā)現(xiàn)膽汁對(duì)成纖維細(xì)胞的增長(zhǎng)有促進(jìn)作用。而運(yùn)用參附注射液干預(yù)后，成纖維細(xì)胞的增殖受到了抑制。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)計(jì)并成功制作的模型能夠說(shuō)明膽汁環(huán)境對(duì)成纖維細(xì)胞增值有一定促進(jìn)作用。通過(guò)分析證實(shí)，參附注射液對(duì)膽汁環(huán)境中成纖維細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用。并且在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)對(duì)膽汁環(huán)境中成纖維細(xì)胞抑制的程度與參附注射液的濃度及干預(yù)的時(shí)間存在正相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，膽汁環(huán)境不利于膽道損傷的自我修復(fù)，可能會(huì)使瘢痕過(guò)度增生。而早期應(yīng)用一定劑量的參附注射液可以在一定程度上減輕膽道瘢痕的過(guò)度增生，從而有可能減少膽道狹窄的發(fā)生率或狹窄程度。但由于膽道損傷后瘢痕形成致使膽管逐漸狹窄的過(guò)程十分復(fù)雜，同時(shí)受到很多因素的影響，因此，還需進(jìn)行長(zhǎng)期深入的探索，才有可能發(fā)現(xiàn)更為有效的治療方法。

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[收稿2015-04-29;修回2015-05-24]

(編輯：王福軍)

臨床醫(yī)學(xué)研究

Study of Shenfu injection on fibroblasts in bile environment

YangKai,LiuLi,ZhouGeng，ZhangHaijun

(Department of Hepatobiliary Surgery, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

[Abstract]Objective To analyze the effect of Shenfu injection on fibroblasts in bile environment in order to judge whether fibroblast proliferation could be inhibited by Shenfu injection to reduce biliary stricture. Methods Fibroblasts growth model was established in bile environment,which was intervened by Shenfu injection. We divided the groups into the blank control group, bile group and experimental groups that was divided into 5 subgroups according to the concentrations .We calculate OD value of the fibroblasts by the MTT method to analyze whether Shenfu injection could inhibit the formation of fibroblasts. We used SPSS20.0 software for statistical analysis.Results The OD values decreased gradually with Shenfu injection concentration and intervention time (P<0.05).Conclusion In bile environment, the fibroblasts could be inhibited by Shenfu injection.

[Key words]Shenfu injection；fibroblast；bile environment

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中圖法分類(lèi)號(hào)] R657.4 A

[文章編號(hào)]1000-2715(2015)03-0271-04

[基金項(xiàng)目]貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(NO:黔衛(wèi)發(fā)[2009]122)。

[通信作者]劉莉，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：膽道損傷，E-mail:li88li@yeah.net。