大鼠雙側(cè)卵巢摘除術(shù)比較

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大鼠雙側(cè)卵巢摘除術(shù)比較

劉波，劉佳云，李菲，龔其海

(遵義醫(yī)學院 藥理學教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室 ，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 3種大鼠雙側(cè)卵巢摘除術(shù)的比較。方法 采用腹部切口法、背部切口法及腹股溝切口法摘除雌性大鼠雙側(cè)卵巢，通過手術(shù)所需時間、摘除雙側(cè)卵巢后動物死亡率及體重變化以比較3種大鼠雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。結(jié)果 通過腹部切口完成手術(shù)所需時間為(9.75±1.58)min，背部切口所需時間為(9.00±1.46)min，腹股溝切口所需時間為(11.1±1.76)min，背部切口法所需時間明顯少于腹股溝切口法(P<0.05)；3種方法術(shù)后均無死亡；術(shù)后前3 d，背部切口法體重下降較其他方法平穩(wěn)；3種方法切除卵巢后陰道脫落細胞周期均消失，血清中雌激素水平較假手術(shù)組明顯下降，卵泡刺激素變化沒有統(tǒng)計學意義。結(jié)論 在3種大鼠雙側(cè)卵巢摘除術(shù)中，背部切口法操作簡便易行，術(shù)后對動物體重影響小，值得推廣應用。

[關(guān)鍵詞]卵巢摘除術(shù)；體重；大鼠

雙側(cè)卵巢切除術(shù)(去勢造模)被廣泛應用于制備骨質(zhì)疏松模型和其他去除雌激素影響的模型[1-2]。非人類的靈長類物種切除雙側(cè)卵巢后，出現(xiàn)類似于人類雌激素減少的現(xiàn)象如生殖周期的停止、骨密度降低和動脈硬化等，但由于價格高昂、數(shù)量有限等因素限制了這種動物的使用。而大鼠作為最常用的實驗動物之一，被廣泛應用于各種實驗中，其中包括雙側(cè)卵巢切除術(shù)。目前切除大鼠雙側(cè)卵巢的方法有腹部切口法、背部切口法和腹股溝切口法[3]。這3種手術(shù)方法在以往的研究中均有采用[4-6]，然而這3種方法中哪一種方法安全性更好、操作更簡便、對大鼠體重的影響更小、成模率如何，目前尚不清楚。因此，本研究對切除大鼠雙側(cè)卵巢的3種手術(shù)方法進行比較，旨在為挑選更優(yōu)的大鼠雙側(cè)卵巢摘除術(shù)提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物與材料SPF級雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠35只，體重230±20 g(購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心(許可證分別為:SCXK(渝)2012-0005)。手術(shù)固定板、手術(shù)剪、止血鉗、手術(shù)鑷、縫針、手術(shù)縫線、無菌紗布及棉球、手術(shù)孔巾、5 mL注射器、7% 水合氯醛、青霉素注射粉劑(80萬)、卵泡刺激素及雌二醇ELISA試劑盒(美國RD 公司進口分裝)、瑞氏染液和姬姆薩染液(北京索萊寶科技有限公司)、全自動多功能酶標儀(imark 通用酶標儀，美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1分組分為腹部切口組、背部切口組、腹股溝切口組、假手術(shù)組，前3組每組10只，假手術(shù)組5只。

1.2.2造模方法從打開腹腔開始計時，到切口縫合完畢截至。所有操作均由1個人完成。

腹部切口組：大鼠術(shù)前禁食12 h，采用7%水合氯醛 0.5 mL/100 g腹腔麻醉后，仰臥位固定。備皮，用碘酊消毒手術(shù)區(qū)，75%乙醇脫碘2次，鋪手術(shù)孔巾，嚴格無菌狀態(tài)下，沿腹白線切口打開腹腔，找到“Y”型子宮，沿每側(cè)子宮找到粉紅色綠豆大小的卵巢，在卵巢和子宮交接處結(jié)扎，徹底切除兩側(cè)卵巢，逐層縫合皮膚。局部碘酊消毒，肌注青霉素(20萬單位/只)預防感染，監(jiān)測大鼠死亡情況及術(shù)后1周的體重變化。

背部切口組：禁食、麻醉同上。俯臥位固定，剪去術(shù)區(qū)的鼠毛備皮，用碘酊消毒，75%乙醇脫碘2次，鋪上手術(shù)孔巾，嚴格無菌狀態(tài)下，在背部肋弓下行1 cm左右，脊柱側(cè)面1 cm處切口，逐層切開，暴露腹腔。分離性腺周圍的脂肪組織，找到卵巢，結(jié)扎卵巢周圍血管，切除卵巢，然后逐層縫合，同法摘除另一側(cè)卵巢。局部碘酊消毒，肌注青霉素。監(jiān)測大鼠死亡情況及術(shù)后1周的體重變化。

腹股溝切口組：禁食、麻醉同上。仰臥位固定，于腹股溝中點切開1～1.5 cm切口，分離皮下組織和肌肉，打開盆腔，找到并切除卵巢，步驟同腹部切口法。

假手術(shù)組只從腹部正中打開腹腔，找到卵巢，但不切除。術(shù)后觀察大鼠傷口開裂以及傷口感染的情況。

1.2.3陰道涂片觀察 從術(shù)后2周開始每日同一時間段對各組大鼠進行陰道涂片觀察。將大鼠固定，抖掉或擦凈排泄物，用沾有生理鹽水的小棉簽從陰道口緩慢輕柔插入大鼠陰道并且緩慢轉(zhuǎn)動，然后將棉簽緩慢抽出。涂片，按照操作步驟進行瑞氏-姬姆薩染色，顯微鏡下觀察有無細胞形狀的變化周期[7]。

1.2.4激素測定 于術(shù)后4周測定血清中卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)、雌二醇(estradio, E2)激素水平。經(jīng)腹主動脈采血3～5 mL，3 000 r/min離心10 min，取血清置于微量離心管中分別標號，-80 ℃冰箱保存。血清中雌激素、 FSH水平檢測按照試劑盒說明書，采用酶聯(lián)免疫法進行檢測。

2結(jié)果

2.1手術(shù)耗時及死亡率從備皮開始計時，傷口縫合完畢結(jié)束。腹部切口組所需時間為9.75±1.58 min，腹股溝切口組所需時間為11.1±1.76 min，背部切口組所需時間為9.00±1.46 min(與腹股溝組相比，P<0.05)，背部切口組較其他兩組手術(shù)時間明顯減少(見圖1)。3種方法切除卵巢后各組大鼠均無死亡、傷口均未開裂、無傷口感染。

經(jīng)單因素方差分析，多組之間兩兩比較：與腹股溝切口組比較，*P<0.05。圖1　3種方法摘除卵巢所需的時間

2.2卵巢摘除術(shù)后大鼠體重的變化與假手術(shù)相比，卵巢切除后第3天大鼠體重均略有下降，隨后開始穩(wěn)步上升，背部切口組在術(shù)后3 d體重下降趨勢不明顯(見圖2)。

圖2　卵巢摘除術(shù)后大鼠體重的變化±s, n=5)

2.3血清雌激素及卵泡雌激素水平的變化與空白對照組相比，3種方法切除卵巢后大鼠均未出現(xiàn)動情期，且雌激素均明顯下降(與假手術(shù)組相比，P<0.05)，而卵泡刺激素水平無明顯差異(見表1)。

2.4陰道細胞形狀的周期變化通過細胞涂片觀

察陰道細胞形狀的周期變化(見圖3)。陰道分泌物中有大量的有核上皮細胞，橢圓形，核深染 (見圖3A)； 動情期:有大量的無核的角化上皮細胞，落葉狀堆積(見圖3B)； 動情后期：白細胞開始增多，可見有核上皮細胞(見圖3C)； 動情間期: 動情后期陰道涂片，有比例相當?shù)慕腔掀ぜ毎⒂泻松掀ぜ毎桶准毎?見圖3D)[7]。

組別出現(xiàn)動情期動物數(shù)雌激素水平(ng/L)卵泡刺激素水平(IU/L)假手術(shù)組5269.8±22.567.28±3.28腹部切口組0132.2±24.7*9.80±3.69背部切口組0143.1±21.0*8.82±1.29腹股溝切口組0141.8±18.1*8.78±2.49

經(jīng)單因素方差分析，多組之間兩兩比較：與假手術(shù)比較，*P<0.05。

A：動情前期；B：動情期；C：動情后期；D：動情間期。圖3　假手術(shù)組陰道涂片細胞形狀周期變化(×400)

3討論

為排除雌激素干擾，動物雙側(cè)卵巢切除模型應用廣泛。卵巢切除后會引起一系列變化，如生殖周期停止、骨密度降低、動脈硬化、雌激素下降等。雌性大鼠去勢模型的制備方法有經(jīng)腹正中切口、經(jīng)背部脊柱旁切口和經(jīng)腹股溝切口。大鼠左側(cè)卵巢位于腰大肌外側(cè)緣，位置靠近背部，從背部開口容易找到卵巢。因腹部經(jīng)常接觸墊料，腹部開口法和腹股溝切口法的感染幾率比較大。此外，從腹部和腹股溝開口手術(shù)過程會碰到腸組織，術(shù)后容易造成腸粘連。并且切口需要2 cm左右才能順利的找到雙側(cè)卵巢。大鼠清醒后撓抓切口，容易使手術(shù)切口裂開。背部傷口兩側(cè)切口感染幾率相對較小，大鼠無法撓及背部傷口，且只需要0.5 cm大的切口便能順利找到卵巢。研究結(jié)果表明背部切口法較其他2種方法，操作時間最少，術(shù)后體重變化不大。選擇用背部切口法切除卵巢，可以減少造模所需時間和避免大鼠體重大幅度降低。

本實驗還通過除瑞氏-姬姆薩染色，觀察陰道脫落細胞有無動情周期出現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)經(jīng)3種方法切除卵巢后，大鼠的動情周期變化沒有規(guī)律, 周期時相變化基本停止,沒有明顯的動情前期和動情期，說明模型均建立成功[8-9]。雌激素、FSH水平是作為判斷卵巢切除成功的標志，本研究采用大鼠酶聯(lián)免疫法試劑盒測定雌激素、FSH 水平變化情況，發(fā)現(xiàn)卵巢切除后雌激素水平明顯低于假手術(shù)組，F(xiàn)SH則無明顯變化,與沈潔、梁秀蘭等測定結(jié)果一致[6,10]。說明3種方法均能成功建立模型。

經(jīng)本研究比較，3種切除雙側(cè)卵巢的方法中，經(jīng)背部切除雙側(cè)卵巢的方法，操作相對簡便易行、術(shù)野暴露好、手術(shù)切口小、術(shù)后對動物體重影響小，大大減少了術(shù)后切口感染和腹腔粘連與疝出的機率，優(yōu)于其他2種方法。同時，本研究也為同屬動物如Wistar大鼠、小鼠等行雙側(cè)卵巢切除的方法提供參考。在單純的去除雙側(cè)卵巢動物模型中，建議使用背部切除雙側(cè)卵巢的方法。

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[收稿2015-03-12;修回2015-04-07]

(編輯：譚秀榮)

Comparison of methods of bilateral ovariectomy in rats

LiuBo,LiuJiayun,LiFei,GongQihai

(Department of Pharmacology and The Key Laboratory of Basic Pharmcology of Guizhou Province,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

[Abstract]Objective To Compare three different methods of bilateral ovariectomy in rats.Methods The bilateral ovaries of female rats were removed through abdominal incision, back and groin incision. The time required in this surgery, the mortality, and the weight of the animals were used to compare three methods.Results The period of ovariectomy using abdominal incision were 9.75 + 1.58 min, the time in back incision group were 9.00 + 1.46 min, groin incision group were 11.1 + 1.76 min. The time required in back incision group was significantly less than that in groin incisions group (P<0.05). There was no postoperative death in the three groups. After three days, the weight reduction of groin incision group was mild. The ovarian cycle of vaginal exfoliated cells in three groups were disappearing after ovariectomy, serum estrogen was significantly decreased compared with control group. However, follicle-stimulating hormone showed no significant difference between normal and bilateral ovariectomy groups.Conclusion Among the three method of ovariectomy, the method by back incision is simple; the weight reduction is less in back incision group. So, the method of back incision is worthy of popularization and application.

[Key words]ovariectomy; weight; rat

[文獻標志碼][中圖法分類號] R713.6 A

[文章編號]1000-2715(2015)03-0251-04

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(NO：81060349)；貴州省科技廳社會攻關(guān)計劃(NO：黔科合SY字20083040)；貴州省自然科學基金重點項目(NO：黔科合JZ字20142015)。[通信作者]龔其海，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：神經(jīng)藥理學，E-mail:gqh@zmc.edu.cn。