農(nóng)桿菌介導含硫氨基酸γ-zein轉(zhuǎn)化菊苣的初步研究

張玉,白史且,李聰

(1.四川省草原科學研究院，四川 成都611731；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100094)

農(nóng)桿菌介導含硫氨基酸γ-zein轉(zhuǎn)化菊苣的初步研究

張玉1*,白史且1,李聰2

(1.四川省草原科學研究院，四川 成都611731；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100094)

摘要：含硫氨基酸具有動物營養(yǎng)與免疫相關的重要生理功能，為提高菊苣中含硫氨基酸含量，采用根癌農(nóng)桿菌介導法將玉米種子貯藏蛋白含硫氨基酸基因γ-zein和綠色熒光蛋白GFP融合基因轉(zhuǎn)入到菊苣無菌苗葉片中，經(jīng)過共培養(yǎng)、潮霉素抗性篩選、分化、再生和煉苗, 得到抗性植株。對抗性植株進行PCR、PCR-Southern、斑點雜交和RT-PCR分析，結果表明,外源目的基因已經(jīng)整合到菊苣基因組中并且得到了表達，為提高菊苣含硫氨基酸含量，改善其品質(zhì)奠定了基礎。

關鍵詞：γ-zein基因；菊苣；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；含硫氨基酸

Preliminary studies on transgenic chicory using the sulphur-amino acid gene, γ-zein, mediated byAgrobacteriumtumefacien

ZHANG Yu1*, BAI Shi-Qie1, LI Cong2

1.SichuanGrasslandScienceAcadem,Chengdu611731,China; 2.InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Beijing100094,China

Abstract:Sulfur-containing amino acids have important physiological functions related to animal nutrition and immunity. To improve the sulfur-amino acid content of chicory, leaves of chicory were transformed with the Sulphur-amino acid gene γ-zein, an important prolamin storage protein from Zea mays and a green fluorescent protein (GFP) gene using Agrobacterium mediated transfusion. After co-culture, selective differentiation and regeneration, hygromycin resistant plants were obtained. Resistant plants were detected using PCR, PCR-southern, dot blot hybridization and RT-PCR. The results demonstrated that the γ-zein genes had been integrated into the genome of chicory and expressed on a nucleic acid level in the transgenic plants.

Key words:γ-zein genes; chicory (Cichorium intybus); agrobacterium-mediated transformation; sulphur-amino acid

蛋白短缺包括蛋白含量短缺和營養(yǎng)品質(zhì)低下，是21世紀全球性的嚴重問題，在盡快提高作物品種的蛋白質(zhì)含量的同時，積極改善蛋白質(zhì)的氨基酸組成，提高營養(yǎng)價值，具有重要意義。

含硫氨基酸如甲硫氨酸(也稱為蛋氨酸,methionine,Met)、胱氨酸、半胱氨酸(cysteine, Cys)等是合成蛋白質(zhì)的重要氨基酸，蛋白質(zhì)中含硫氨基酸的含量與種子萌發(fā)、生長和作物品質(zhì)均有密切關系。含硫氨基酸是人體必需氨基酸之一，也是形成動物毛發(fā)角蛋白的必需組分，并且研究表明含硫氨基酸含量的增加可提高羊毛產(chǎn)量22%以上，增產(chǎn)的幅度在22%~104%[1-2]，同時還可增加牲畜的重量，含硫氨基酸的這種獨特作用是別的氨基酸不具有的[2]。如能提高牧草或動物飼料中含硫氨基酸的含量，對提高動物重量、改善動物品質(zhì)，具有重要的經(jīng)濟價值。是穩(wěn)定畜產(chǎn)品價格和確保畜產(chǎn)品安全的有效途徑之一[3]。

菊苣(Cichoriumintybus)為菊科菊苣屬多年生宿根草本植物，其適應性廣，根系發(fā)達，產(chǎn)量高，營養(yǎng)豐富，粗蛋白質(zhì)16.44%～27.35%，菊苣常用作牧草飼料、蔬菜、制糖原料及咖啡的替代品，也是工業(yè)和藥品的生產(chǎn)原料[3-4]。雖然菊苣蛋白質(zhì)含量高，但是蛋白質(zhì)中氨基酸組成不平衡，含硫氨基酸含量較低。

近年來，基因工程的誕生使人類的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)史發(fā)生了巨大的變化，通過轉(zhuǎn)基因技術提高植物抗性、改善織物品質(zhì)，具備并已展現(xiàn)了巨大的應用價值和經(jīng)濟價值[5]。目前已經(jīng)從玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、向日葵(Helianthusannuus)及豌豆(Pisumsativum)等中分離得到富含硫氨基酸的蛋白及其編碼基因。玉米醇溶蛋白(zein)是玉米種子中的主要貯藏蛋白質(zhì)，可分為α-、β-、γ-和δ-zein 4種主要類型。其中β-、γ-和δ-zein富含蛋氨酸和半胱氨酸2種含硫氨基酸[6]。通過轉(zhuǎn)γ-zein基因來提高植物的含硫氨基酸已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7]、煙草(Nicotianatabacum)[8]、白三葉草(Trifoliumrepens)[9]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[10-11]等中取得良好的結果。γ-zein基因的成功轉(zhuǎn)入和表達為增加牧草可食性組織的含硫氨基酸含量提供了新的途徑，但這在菊苣上還沒見報道。本文通過農(nóng)桿菌介導將GFP和γ-zein融合基因轉(zhuǎn)化菊苣，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行檢測，以期提高菊苣植株含硫氨基酸的含量，改善菊苣品質(zhì)，同時也為菊苣新品種的培育提供中間材料。

1材料與方法

1.1　植物材料

普那菊苣(Cichoriumintybuscv. puna)由四川省草原科學研究院提供。普那菊苣是一個產(chǎn)量高、抗蟲性強的國家登記牧草品種。

1.2　質(zhì)粒及菌種

本實驗中使用根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404、植物表達載體pCAMBIA1302和γ-zein基因均由中國農(nóng)業(yè)科學研究院畜牧獸醫(yī)研究所李聰實驗室提供。質(zhì)粒圖譜見圖1。該質(zhì)粒包括CaMV35S啟動子、γ-zein、GFP蛋白基因。

圖1　植物表達載體pCB-GFP-zein結構Fig.1　Schematic maps of plant expression vectors pCB-GFP-zeinLB為左邊界Left T-border;RB為右邊界Right T-border.

1.3　試驗用培養(yǎng)基成分

見表1。

1.4　方法

1.4.1菊苣無菌苗的獲得選取飽滿菊苣種子，經(jīng)體積分數(shù)75%乙醇浸泡2 min，倒出浸泡液，再用0.1%的升汞浸泡10 min，無菌水反復清洗4~5次，無菌濾紙吸干水分后， 接種于1/2 MS培養(yǎng)基上，放于溫室，待植株成苗。

表1　培養(yǎng)基成分

1.4.2菌液的活化參照王關林和方宏藥(2002)的方法，略有變動。取-80℃加入15%甘油保存的菌液于碎冰上融化，用接種針蘸取少量菌液，在添加有50 mg/L Kan和50 mg/L Str的固體平板培養(yǎng)基上劃線，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)2 d。待長出單菌落后，用牙簽挑取單菌落于含50 mg/L Kan和50 mg/L Str的液體LB或YMB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)16～24 h至對數(shù)生長期，然后按1∶100比例轉(zhuǎn)入不含抗生素的新鮮液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振搖培養(yǎng)至OD600達0.6左右。無菌條件下取新鮮菌液于50 mL離心管中于常溫5000 r/min離心10 min，去除上清液，用1/2 MS無菌液體培養(yǎng)基重懸沉淀至需要的OD值，用于侵染轉(zhuǎn)化。

1.4.3轉(zhuǎn)基因抗性植株的獲得選取無菌苗中上部充分展開、生長健壯、均勻一致的幼嫩葉片，用5～10 mm打孔器制取葉盤外植體，將其接種在預培養(yǎng)基中預培養(yǎng)2 d后，用OD600=0.4 Abs農(nóng)桿菌菌液浸泡10 min, 其間不斷搖動，取出后用無菌濾紙吸取受體表面多余菌液，迅速將受體材料移置鋪有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)基上，黑暗中共培養(yǎng)到有肉眼可見微菌落。共培養(yǎng)結束后，將其轉(zhuǎn)入含25 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的篩選培養(yǎng)基中篩選得到抗性芽。當抗性芽長到1 cm時，轉(zhuǎn)入含15 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的分化培養(yǎng)基中擴繁，將擴繁芽轉(zhuǎn)入含10 mg/L Hyg和250 mg/L Cef的生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，直到長成完整的小植株，然后馴化移栽，得到轉(zhuǎn)基因抗性植株。

1.4.4抗性植株的檢測1) PCR檢測

用CTAB法和普博欣植物基因組DNA小量提取試劑盒提取抗性植株及對照(未轉(zhuǎn)化植株)的總DNA，根據(jù)標記基因GFP和目的基因γ-zein序列用primer 5.0設計引物進行PCR擴增，GFP引物序列為：

5′-CAGTGGAGAGGGTGAAGGTG-3′

5′-CGAAAGGGCAGATTGTGTGG-3′

預期擴增長度為538 bp。

γ-zein引物序列為：

5′-TGCCACTACCCTACTCAACCG-3′

5′-GGAGGACCAAGCCGAAGAT-3′

預期擴增長度為283 bp。

以質(zhì)粒pCB-GFP-zein作為陽性對照，以未轉(zhuǎn)化的植株作為陰性對照。PCR反應體系為：10×PCR Reaction Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，基因組DNA 1 μg Taq DNA Polymerase(5 U/μL) 0.5 μg, 添加 ddH2O 補充到 25 μL。PCR反應程序為：94℃ 4 min，94℃ 30 s，50℃ 30 s， 72℃ 1 min，30個循環(huán)， 最后72℃ 10 min。電泳完后，取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，檢測擴增結果。

2) PCR-Southern

以質(zhì)粒pCB-GFP-γ-zein DNA 為模板進行PCR，對PCR產(chǎn)物進行回收，用回收產(chǎn)物做探針標記，具體標記方法見Roche 公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，然后對PCR 產(chǎn)物進行電泳、轉(zhuǎn)膜、預雜交、雜交和顯色檢測，具體方法見Roche 公司的說明書。

3)斑點雜交

對陽性植株DNA變性，冰中速冷。在帶正電荷尼龍膜上用鈍鉛筆劃0.5 cm×0.5 cm方格網(wǎng)，先用蒸餾水浸潤尼龍膜，然后用20×SSC浸泡，用Tip將變性DNA點于膜上，以質(zhì)粒pCB-GFP-zein DNA為陽性對照，以未轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照，每個樣點2~10 μg DNA，室溫晾干，烘烤，進行預雜交、雜交和顯色檢測[12]。

4) 轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測

利用TRIzol法對菊苣陽性轉(zhuǎn)化植株和非轉(zhuǎn)化植株的總RNA進行提取、純化，然后對RNA進行反轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應體系為25 μL，含模板RNA 2 μg，Oligo(dT)15 Primer 1 μL，M-MLV Reaction Buffer 5 μL，Dntp (10 mmol/L) 5 μL，Ribonuclease Inhibitor 1 μL，M-MLV RT 200 U，加DEPC水補足25 μL。用γ-zein基因引物對反轉(zhuǎn)錄的cDNA進行PCR檢測和電泳分析。

2結果與分析

2.1　轉(zhuǎn)基因菊苣獲得

菊苣無菌苗葉片預培養(yǎng)2 d后，葉片邊緣開始膨大，用含pCB-gfp-zein的LBA4404浸染，浸染后的菊苣葉片(圖2A)在黑暗下共培養(yǎng)2~3 d，轉(zhuǎn)于含20 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的篩選培養(yǎng)基上，20 d后分化出具有抗性的不定芽(圖2B)，將抗性芽轉(zhuǎn)入含15 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的分化培養(yǎng)基中擴繁1~2周 (圖2C)，再轉(zhuǎn)入含10 mg/L Hyg和250 mg/L Cef的生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，2~3周后植株生根(圖2D)發(fā)育成完整植株(圖2E)，煉苗室內(nèi)盆栽，最終獲得48株形態(tài)特征正常的菊苣抗性再生植株 (圖2F)。

圖2　轉(zhuǎn)化菊苣分化與再生Fig.2　Differentiation and regeneration of transformed chicory　A:浸染后的菊苣葉片Leaf soaked of chicory；B:不定芽的篩選(箭頭指向為抗性芽) Screen the Hyg-resistant regeneration buds (the arrowed places are the transgene buds);C: 抗性植株生根培養(yǎng)Radicating of the Hyg-resistant regeneration buds； D:抗性芽的分化Differentiation of the Hyg-resistant regeneration buds；E:完整的抗性植株Intact plant；F:移栽成活的抗性植株The survival Hyg-resistant regeneration plant transplanted to plate.

2.2　抗性植株的PCR檢測

提取轉(zhuǎn)化抗性植株DNA，用GFP基因和γ-zein基因引物分別對轉(zhuǎn)化植株及非轉(zhuǎn)基因植株總DNA進行PCR擴增，結果顯示轉(zhuǎn)化的48株抗性再生植株中有29株能擴增出γ-zein基因的283 bp預期片段，只列出部分PCR圖(圖3)，有26株能擴增出GFP基因538 bp的預期片段(圖4，只列出部分PCR圖)，而非轉(zhuǎn)基因植株均未擴增出任何條帶(圖3,圖4)。

圖3　轉(zhuǎn)基因植株γ-zein-PCR 檢測Fig.3　PCR analysis of γ-zein gene from transformed chicory　　　1: DL 2000 DNA marker;2: pCB-gfp-zein質(zhì)粒Plasmid pCB-gfp-zein;3:陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣) Negative control(non-transgenic );4~10:轉(zhuǎn)化植株Transformed plants.

圖4　轉(zhuǎn)基因植株gfp-PCR 檢測Fig.4　PCR analysis of gfp gene from transformed chicory

2.3　抗性植株的PCR-Southern檢測

對gfp 和γ-zein基因PCR檢測都為陽性的植株進行γ-zein-PCR——Southern檢測，檢測結果(圖5)表明：檢測的植株都為陽性，初步說明外源目的基因γ-zein已經(jīng)轉(zhuǎn)化到菊苣基因組中。

圖5　轉(zhuǎn)基因植株γ-zein-PCR-Southern 檢測Fig.5　PCR-Southern analysis of γ-zein gene from transformed chicory

M: DL 2000 DNA marker; P: pCB-gfp-zein質(zhì)粒Plasmid pCB-gfp-zein; CK: 陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣) Negative control(non-transgenic );1~7: 轉(zhuǎn)化植株Transformed plants.1: pCB-gfp-zein質(zhì)粒Plasmid pCB-gfp-zein; 2: 陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣) Negative control(non-transgenic);3~7: 轉(zhuǎn)化植株Transformed plants.

2.4　抗性植株的斑點雜交檢測

對上面檢測均為陽性的轉(zhuǎn)基因植株DNA進行斑點雜交，所用探針為pCB-gfp-zein質(zhì)粒DNA的γ-zein-PCR回收產(chǎn)物，雜交結果顯示(圖6)：除陰性對照外，轉(zhuǎn)基因植株都有雜交信號，說明γ-zein已經(jīng)整合到菊苣基因組中。

圖6　轉(zhuǎn)基因植株γ-zein斑點雜交檢測Fig.6　Dot blot hybridization analysis of γ-zein gene　　　P: pCB-gfp-zein質(zhì)粒Plasmid pCB-gfp-zein; CK: 陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣) Negative control (non-transgenic);1~8: 轉(zhuǎn)化植株Transformed plants.

2.5　抗性植株的RT-PCR檢測

采用TRIzol法對菊苣轉(zhuǎn)化植株和未轉(zhuǎn)化植株提取RNA，經(jīng)檢測RNA質(zhì)量良好(圖7)，經(jīng)過RT-PCR檢測，結果表明(圖8),除1株為陰性外其余都為陽性，表明大部分基因在轉(zhuǎn)基因菊苣植株中得到了表達。檢測表明陰性的植株是假陽性，還是在RNA上沉默，還有待Southern雜交的進一步檢測。

圖7　提取的植株RNA Fig.7　RNA extraction of plants

圖8　轉(zhuǎn)基因植株γ-zein-RT-PCR 檢測Fig.8　RT -PCR analysis of γ-zein gene 　　　1: DL 2000 DNA marker; 2:pCB-gfp-zein質(zhì)粒Plasmid pCB-gfp-zei; CK: 陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣) Negative control (non-transgenic);3~8: 轉(zhuǎn)化植株Transformed plants.

3結論與討論

改進農(nóng)作物品質(zhì)歷來為各國科學工作者所重視。菊苣中缺乏蛋氨酸和半胱氨酸, 蛋氨酸和半胱氨酸成了其營養(yǎng)限制,菊苣是一個多用途的經(jīng)濟作物、藥用植物和飼料作物, 提高其蛋氨酸和半胱氨酸含量具有巨大的潛在經(jīng)濟價值。該論文以菊苣無菌苗葉片為外植體，利用根癌農(nóng)桿菌介導法對含硫氨基酸γ-zein基因和GFP基因的融合基因轉(zhuǎn)移到菊苣的研究，迄今還未見報道。在菊苣中利用基因工程法進行基因轉(zhuǎn)化的報道并不多見，目前在國內(nèi)外報道的只有與花發(fā)育相關AFL2基因[13]、β-glucuronidase (uidA)基因[14]、抗壞血酸過氧化物酶(APX)基因[15]、pBI121-GFP載體[16]、菊苣中分離克隆的DREB基因[17]和茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(ALNHX)[18]被導入菊苣，并且這些報道都只做了最初的PCR檢測，沒有在RNA的表達上進行檢測。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化中，預培養(yǎng)的主要作用是促進細胞分裂，因為處于分裂狀態(tài)的細胞更易整合外源DNA，提高轉(zhuǎn)化率。研究發(fā)現(xiàn)菊苣預培養(yǎng)時間比較短，只需要2 d即可，如果預培養(yǎng)時間超過3 d，外植體邊緣除了膨大外，還開始分化出綠點，影響轉(zhuǎn)化效率。根癌土壤農(nóng)桿菌只能感染植物的損傷部位，在植物細胞損傷及修復過程中，植物細胞釋放出一些化學物質(zhì)(酚類物質(zhì)、酸性多糖等)，這些誘導物可以通過外膜蛋白將環(huán)境中的植物損傷信號傳遞到農(nóng)桿菌細胞內(nèi)，最終引起vir 基因的表達和T-DNA 的轉(zhuǎn)移。其中誘導效果最佳的為乙酰丁香酮(AS)，它可以使農(nóng)桿菌質(zhì)粒上的vir 基因活化，提高轉(zhuǎn)化率。也有報道稱AS對于轉(zhuǎn)化效果沒有明顯影響。本研究中得出共培養(yǎng)中AS濃度對抗性率影響差異顯著，其中以濃度為100 μmol/L最佳。有報道AS 對于河北楊的侵染轉(zhuǎn)化并沒有促進效果，隨著施加濃度的增加反而還會產(chǎn)生一定的抑制作用。不同研究獲得結果不一致，可能與所選用材料、菌液濃度和菌株的類型有關系。

PCR的高度靈敏極易產(chǎn)生假陽性結果。DNA插入植物基因組后易發(fā)生重排，即使載體上的抗性基因或其他基因能表達， 目的基因也未必完整的存在于轉(zhuǎn)化體中，從而造成檢測結果的假陽性。而且，轉(zhuǎn)基因植株存在基因沉默等現(xiàn)象，影響外源基因的正常表達，因此，轉(zhuǎn)基因PCR檢測結果可能不是百分之百準確，所以，除了PCR檢測外，還有必要在DNA水平用點雜交、Southern Blot檢測，在RNA表達水平上用RNA-PCR進行檢測。本文通過轉(zhuǎn)化葉片進行不同濃度梯度潮霉素的篩選，分化和再生得到了菊苣抗性植株，通過PCR、PCR-Southern和斑點雜交檢測證明了γ-zein基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化到菊苣基因組中。再通過RT-PCR進一步證明了γ-zein基因已整合到菊苣基因組中，并在轉(zhuǎn)錄水平上得到了正確表達，并且該轉(zhuǎn)化方法抗性率高，陽性率也較高，為菊苣以后的遺傳轉(zhuǎn)化和育種中間材料的創(chuàng)制奠定了基礎。一個完整的轉(zhuǎn)基因植株的檢測應該包括DNA、RNA方面的檢測，還應該包括該基因表達產(chǎn)物的檢測。本試驗中，γ-zein基因表達的產(chǎn)物主要為含硫氨基酸的蛋氨酸和半胱氨酸，但是由于含硫氨基酸在轉(zhuǎn)基因菊苣中表達量的檢測，需要一定量的菊苣干樣并打成草粉，因此，該指標只有等到轉(zhuǎn)基因菊苣單株樣品比較多的情況下才能進行測定。

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通訊作者*Corresponding author.

作者簡介：張玉(1975-)，女，四川仁壽人，博士。E-mail：zhyforage@126.com

基金項目：四川省十二五牧草育種攻關(2011NZ0098-11)，四川省應用基礎項目(2013JY0111)和國家牧草產(chǎn)業(yè)技術體系阿壩綜合試驗站資助。

收稿日期：2014-07-07；改回日期：2015-03-10

DOI：10.11686/cyxb2014307http://cyxb.lzu.edu.cn